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FHL2蛋白与心脏Kv1．5钾通道相互作用的研究被引量：1: 2013年; 目的目前认为KCNA5通道蛋白是治疗房颤的一个理想靶点,文中旨在验证FHL2蛋白与KCNA5基因编码的心脏Kv1.5钾通道是否存在相互作用。方法①质粒构建:应用PCR法构建质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2;②基因转染:应用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5质粒和pcDNA3.0-FHL2质粒共转染HEK293细胞;③免疫共沉淀:应用抗FHL2抗体和Protein A/G Plus-Agarose沉淀目的蛋白,应用抗Myc抗体进行Western blot分析;④免疫荧光细胞化学分析:应用抗FHL2一抗和标记有FITC的二抗检测FHL2蛋白,应用抗Myc一抗和标记有Cy3的二抗检测KCNA5-Myc融合蛋白。结果①酶切和测序结果表明质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2构建正确;②抗FHL2抗体能够将KCNA5从总蛋白中沉淀下来;③KCNA5蛋白和FHL2蛋白共定位于细胞膜上。结论初步证实FHL2蛋白与KCNA5蛋白存在相互作用。; 余宏马青艳林吉进; 关键词：FHL2 钾通道免疫共沉淀

应用酵母双杂交技术筛选HERG钾通道相互作用蛋白被引量：2: 2012年; 目的筛选心肌细胞内哪些蛋白质与HERG钾通道存在相互作用。方法 (1)通过PCR方法扩增编码心脏herg基因N端的cDNA片段(HERG-NT,aa 1-403)和C端的cDNA片段(HERG-CT,aa 669-1159),分别克隆进入pGBKT7载体,构建pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT诱饵质粒;(2)将被诱饵质粒转化的AH109分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/X-α-Gal平板上,以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因;(3)将已被诱饵质粒转化的AH109分别与预转染于Y187的人类心脏cDNA文库进行酵母双杂交,分离阳性克隆中的cDNA,并测序。结果 (1)成功构建诱饵载体pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT,测序结果表明herg-NT和herg-CT都和"GAL4 DNA-BD-C-Myc"在同一读框,没有PCR引起的突变;(2)"诱饵"蛋白HERG-NT和HERG-CT均未能自我激化报告基因Ade2、Mel1和LacZ,弱激活报告基因His3,应用5mmol/L的3-AT可以有效抑制HERG-NT或HERG-CT所引起的组氨酸表达;(4)经过严格筛选后,发现Caveolin-1、FHL2和PTPN12等15种蛋白与HERG-NT存在相互作用,Myotrophin等8种蛋白与HERG-CT相互作用。结论成功应用酵母双杂交技术,以HERG钾通道蛋白的氨基端或羧基端为诱饵蛋白,筛选HERG钾通道的相互作用蛋白(Caveolin-1、FHL2、PTPN12、Myotrophin等),这些蛋白质可能与HERG存在相互作用。; 孙一帆郑芳芳余宏马青艳林吉进; 关键词：HERG钾通道蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12负性调控心脏HERG钾通道电流被引量：3: 2013年; 目的研究蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12(PTPN12)对心脏HERG钾通道电流的调控作用。方法(1)质粒构建和基因转染:PCR技术构建各种质粒,应用脂质体将各种质粒转染HEK293细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞株;(2)应用抗PTPN12抗体进行Western blotting分析检测PTPN12的表达;(3)细胞电生理检测:应用膜片钳技术检测单独表达HERG组(HEK293/HERG细胞)、PTPN12过度表达组(将pCDNA3.1-PTPN12-RFP转染HEK293/HERG细胞)、PAO处理组(PTPN12/HERG组基础上加入抑制剂PAO)、herg突变组(将pCDNA3.1-PTPN12-RFP转染HEK293/HERGY327A-Y700A-Y845A细胞株)的HERG钾通道电流。结果(1)成功构建herg突变质粒和pCDNA3.1-PTPN12-RFP质粒,并获得稳定表达的细胞株;(2)共转染pCDNA3.1-PTPN12-RFP质粒的HEK293/HERG细胞在荧光显微镜下可观察到PTPN12-RFP在细胞中的表达,Western blotting可检测到PTPN12的表达;(3)PTPN12过度表达组脉冲电流密度明显低于对照组(P<0.01),PAO处理组和herg突变组电流密度明显高于PTPN12/HERG组(P<0.01)。结论 PTPN12对心脏HERG钾通道电流具有明显负性调控作用,其可能机制是PTPN12减弱了HERG钾通道酪氨酸磷酸化程度。这一发现有助于更深刻理解HERG钾通道调控机制和长QT综合征发病机制。; 林吉进刘树楷郑方芳马青艳余宏任莉沈心远; 关键词：长QT综合征 HERG钾通道

Caveolin-1对心脏HERG钾通道功能调控作用的研究被引量：2: 2013年; 目的既往研究发现caveolin-1参与了多种心脏离子通道的调控作用,但对心脏HERG钾通道是否具有调控作用,则未见报道。研究caveolin-1对心脏HERG钾通道功能的调控作用。方法①基因转染:应用Lipofectamine 2000将pcDNA3.0-caveolin-1质粒和pcDNA3.0-herg转染HEK293细胞,通过G418筛选获得稳定表达细胞株;②脂筏破坏:通过在培养液中加入10mmol/L的甲基-β-环糊精,去除HEK293/HERG细胞膜上的脂筏;③Caveolin-1表达抑制:应用siRNA转染HEK293/HERG细胞抑制caveolin-1表达;④Caveolin-1过度表达:将pcDNA3.0-herg转染HEK293/caveolin-1细胞株,获得caveolin-1过度表达的HEK293/HERG细胞;⑤应用膜片钳技术记录经不同处理后的HERG通道电流。结果①细胞膜脂筏破坏与caveolin-1表达抑制均能显著增大HERG钾通道电流幅度和显著加速尾电流去激活速率;②Caveolin-1过度表达则显著减小了HERG通道电流的振幅并显著缓慢了尾电流的去激活速率。结论 Caveolin-1对心脏HERG钾通道的功能具有负性调控作用。; 马青艳余宏林吉进; 关键词：HERG钾通道 CAVEOLIN-1 RNA干扰脂筏膜片钳技术

Caveolin-1蛋白与心脏HERG钾通道相互作用的研究: 2013年; 目的验证Caveolin-1蛋白与HERG钾通道是否存在相互作用,并进一步明确发生相互作用的区域。方法(1)将携带不同Caveolin-1片段的pGADT7载体转染Y187,随后分别与转化有pGBKT7-herg-NT或pGBKT7-hergCT的AH109进行酵母双杂交;(2)应用免疫共沉淀技术验证Caveolin-1与HERG之间的相互作用;(3)免疫荧光细胞化学分析:pcDNA3.1-HERG和pcDNA3.0-Caveolin-1质粒共转染HEK293细胞,应用特异性抗体和荧光标记二抗显示Caveolin-1及HERG的亚细胞定位,应用激光共聚焦显微镜观察。结果 (1)酵母双杂交发现,Caveolin-1与HERG氨基端相互作用,且其寡聚化结构域是必需片段,而Caveolin-1羧基端则与HERG羧基端相互作用;(2)抗Caveolin-1的抗体能够从心肌裂解物中沉淀HERG通道蛋白;(3)Caveolin-1蛋白和HERG通道共定位于细胞膜上。结论Caveolin-1与心脏HERG钾通道存在相互作用,Caveolin-1的寡聚化结构域是HERG氨基片段的相互作用区域,而HERG羧基片段则与Caveolin-1的羧基端相互作用。; 马青艳余宏林吉进; 关键词：CAVEOLIN-1 HERG钾通道免疫共沉淀

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11对人类果蝇相关基因钾通道的调控作用被引量：1: 2015年; 目的由人类果蝇相关基因(Human ether-a-go-go-related gene,HERG)编码的钾通道电流的改变可引起长QT综合征,HERG钾通道受到蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶的调节,且蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 12,PTPN12)具有负性调控HERG钾通道的作用。文中旨在探讨PTPN11对HERG钾通道电生理特性的影响。方法应用PCR技术,构建携带pc DNA3.1-PTPN11-EGFP的质粒;利用脂质体Lipofectamine2000,将各质粒转染进入HEK293细胞;应用膜片钳技术,分别检测对照组(pc DNA3.0-HERG-EGFP单独转染HEK293细胞)、PTPN11过表达组(pc DNA3.0-HERG与pc DNA3.1-PTPN11-EGFP共转染HEK293细胞)以及抑制剂组(pc DNA3.0-HERG与pc DNA3.1-PTPN11-EGFP共转染HEK293细胞基础上加入蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂正钒酸钠)的HERG钾通道的脉冲电流最大电流密度、尾电流最大电流密度及去激活时间常数Tau等。结果成功构建了pc DNA3.1-PTPN11-EGFP质粒。在荧光显微镜下可观察到各组中带有增强型绿色荧光蛋白的质粒表达。膜片钳检测发现,PTPN11过表达组的脉冲电流最大电流密度[(31.85±5.54)p A/p F]、尾电流最大电流密度[(73.82±11.31)p A/p F]较对照组[(45.92±3.18)、(108.43±7.98)p A/p F]均降低(P<0.05);而抑制剂组脉冲电流、尾电流最大电流密度[(48.08±4.32)、(120.06±8.02)p A/p F]较对照组与PTPN11过表达组均明显增大(P<0.05)。PTPN11过表达组去激活时间常数Tau[(622.16±46.49)ms]较对照组[(440.70±49.49)ms]明显升高(P<0.05)。结论 PTPN11对心脏HERG钾通道的电流具有负性调控作用,而酪氨酸磷酸酶抑制剂能逆转PTPN11过表达的HERG钾通道电流的减小,这一发现为应用HERG钾通道的某些调控酶作为治疗长QT综合征的治疗思路提供了一定的理论基础。; 任莉沈心远林吉进; 关键词：膜片钳技术长QT综合征

FHL2蛋白对心血管系统的调控作用被引量：1: 2013年; 由4个半LIM 结构域组成的FHL家族蛋白（four and a half LIM domains protein）包括FHL1、FHL2、FHL3、FHT4 和ACT.FHL2蛋白参与多种蛋白质的相互作用以及多种转录因子、骨架蛋白、酶等的调控作用.这些作用已经发现在包括心律失常、心肌肥厚、动脉粥样硬化和心血管新生成等方面充当各种重要的角色.而心血管系统是一个精细而复杂的调控系统,心肌拥有复杂、内在的机制来调控相应的心肌重构.很多类型的蛋白,包括结构和信号网络,用于维持机体内稳态以及对环境压力的响应.; 余宏马青艳林吉进; 关键词：心血管系统 FHL2 心肌肥厚家族蛋白转录因子

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广东省自然科学基金(S2012010009324)

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