湖北省自然科学基金(2005ABA151)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用被引量：1
- 2007年
- 目的构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53,并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法利用基因工程技术,将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA (0.5 kb)亚克隆至pIRES载体中,通过聚合酶链反应(PCR)、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中,并筛选出阳性克隆,流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期;逆转录(RT)-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果成功构建出双质粒表达载体plRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞,瘤细胞生长速度较前缓慢,群体倍增时间比转染前增加了2.3倍,且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡;流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G,期;RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达,转染MG-63后24、48、72、96 h瘤细胞生长抑制率分别为:33.43%、69.37%、66.19%、75.26%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论μ野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡,为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。
- 李进杨述华邹利军邵增务廖翔
- 关键词：骨肉瘤启动子脱噬作用基因治疗
- 单启动子p53/p14^(ARF)非融合表达载体的构建及其在MG-63中的表达鉴定被引量：2
- 2007年
- 目的构建单启动子非融合表达载体pIRES-p53-p14^(ARF)并观察其对骨肉瘤细胞增殖生长的影响及其功能初探。方法将p53与p14^(ARF)全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中,并通过PCR、酶切鉴定重组质粒。用Lipofectamin 2000将野生型pIRES-p53-p14^(ARF)真核表达载体转染MG-63细胞,48h后采用axiovent200型倒置显微镜、荧光免疫细胞化学,观察其在细胞内的表达并初步探究其抑瘤功能。结果成功构建出含p53与p14^(ARF)全长基因片段的单启动子非融合表达载体pIRES-p53-p14^(ARF)。RT-PCR,酶切鉴定质粒大小、位点均符合实验设计。荧光免疫细胞化学检测显示p53阳性细胞同时也表现为p14^(ARF)免疫反应阳性,转染后瘤细胞可见散在凋亡现象。结论pIRES-p53-p14^(ARF)非融合表达载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功。
- 邹利军杨述华李进杨渝珍梅荣成
- 关键词：非融合表达
- p16ink4a/hRb1对骨肉瘤细胞周期协同的调控作用
- 2006年
- 目的观察外源性p16ink4a/hRb1基因联合导入骨肉瘤细胞后,对其细胞周期的协同调控作用。方法利用本室构建的pIRES-p16ink4a-hRb1、pIRES-p16ink4a与pIRES-hRb1质粒,脂质体介导转染p16缺失,hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MC-63,G418筛选获得抗性克隆,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot半定量分析外源基因表达；Sub G_1法流式细胞术分析细胞周期特异性和凋亡率。噻唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比,所有外源性基因导入组细胞周期均显著阻滞在G_1期(P＜0．01)并存在凋亡,且双基因导入组凋亡率分别比单基因组高4．04和6．94倍(P＜0．01)；所有外源性基因导入组各时间点细胞生长抑制率均显著上升,且双基因导入组细胞高于单基因组(P＜0．01)。结论p16ink4a/hRb1联合导入骨肉瘤细胞后,干扰了p16ink4a-Cy- clinD1/CDK-hRb1负反馈循环,比单基因导入更能抑制肿瘤细胞生长和杀灭肿瘤细胞。
- 廖翔杨述华邵增务李进刘勇熊小芊
- 关键词：骨肉瘤细胞周期流式细胞术
- 单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及对骨肉瘤细胞增殖的抑制(英文)
- 2007年
- 背景:以往的研究表明,ADp14ARF转染p53阳性的肿瘤细胞系,可以发现明显的细胞增殖受阻现象。而转染p53阴性的肿瘤细胞系,尽管也可见肿瘤细胞增殖受阻,但在程度上明显轻于前者。同时转染p14ARF和p53两种基因,既增强p53表达又加强p53积累,能否更易促进肿瘤细胞凋亡?目的:利用基因工程技术构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53,并观察其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。设计:随机对照观察。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。材料:实验于2005-01/2006-10于华中科技大学同济医学院基础医学院免疫教研室公共实验平台完成。人骨肉瘤MG-63细胞有华中科技大学同济医学院免疫教研室细胞室提供。含p53全长基因序列的质粒pIRES-p53和pIRES载体均购自武汉晶赛生物公司。方法:利用基因工程技术,将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA(0.5kb)亚克隆至pIRES载体中,通过PCR、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中,并筛选出阳性克隆,将细胞分为3组:空白对照组(MG-63细胞),空载体对照组(稳定转染pIRES-neo细胞),p14ARF-p53组(稳定转染pIRES-p14ARF-p53细胞)。①采用流式细胞仪测定转染前后瘤细胞DNA含量和细胞周期。②逆转录PCR(RT-PCR)和Westernbolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。③采用噻唑蓝比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。主要观察指标:①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期。②瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达。③细胞增殖情况。结果:成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期:流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期。②蛋白表达检测结果:RT-PCR与Westernblot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。③细胞生长�
- 李进杨述华邹利军邵增务廖翔
- 关键词：凋亡基因治疗
