国家自然科学基金(30672281)
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
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- 相关机构：复旦大学上海医学院复旦大学更多>>
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- 脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白融合基因载体的构建、鉴定及初步应用研究
- 2009年
- 目的构建脑源性神经营养因子（BDNF）绿色荧光蛋白（GFP）融合表达质粒，观察其融合蛋白的特性。方法将BDNFcDNA片段插入pcDNA3．1／NT-GFP—TOPO真核表达质粒，使其与GFP同处一个阅读框架中，测序鉴定后，转染培养的雪旺细胞，用免疫组织化学和蛋白质印迹（Western botting）观察外源性目的蛋白的表达情况，并用该质粒活体转染视神经切断的大鼠模型，观察所表达外源性蛋白的神经保护作用。结果测序证实质粒构建成功。Westernbotting结果显示，BDNF—GFP融合蛋白表达一相对分子质量为41×10^3。大小条带。荧光显微镜下可见BDNF～GFP转染的细胞发出绿色荧光，免疫组织化学染色后，可见绿色荧光与红色荧光完全重合。转染BDNF—GFP质粒和GFP质粒的大鼠视神经切断术后7d存活视网膜神经节细胞（RGC）分别为（1201±286）、（482±151）个／mm^2，存活百分比分别为（51．39±12．24）％和（20．62±6．46）％；28d时存活的RGC分别为（715±71）、（112±24）个／mm^2，存活百分比分别为（30．59±3．04）％和（4．79±1．03）％。两组存活百分比比较，差异有统计学意义（t=3．144，11．378；P〈0．01）。结论BDNF-GFP融合表达载体可以转录翻译为一融合蛋白，该蛋白可自发绿色荧光，并具有BDNF的生物学活性。
- 方媛樊嘉雯莫晓芬孙兴怀郭文毅孔德升马端田洁
- 关键词：基因疗法动物实验
- 在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮细胞层和光感受器细胞层的实验研究
- 2010年
- 目的探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮（RPE）细胞层和光感受器（PR）细胞层的可行性。方法147只健康雄性Spragne—Dawley（SD）大鼠根据电穿孑L刺激模式电压值分为5、10、15、20、25、30、35V组，右眼视网膜下腔注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达质粒pEGFP—N1为实验眼，左眼注射TE Buffer为对照眼。各组根据不同转染方向再分为RPE和PR两个亚组。各组除电压不同外，其余参数均为脉宽99ms，脉冲间期0．5s，连续5个脉冲。将带有负电荷的质粒在电场作用下，拟转染到RPE细胞层，反向置电极，拟转染到PR细胞层。转染后7d取各组视网膜铺片，荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围及荧光细胞计数分析；采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）、实时逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达。结果转染后7d，荧光显微镜观察发现，各组RPE亚组对照眼RPE细胞层内均未见特异性荧光表达，实验眼可见绿色荧光表达；各组RPE亚组对照眼视网膜铺片均未见荧光表达，实验眼视网膜铺片均可见转染了EGFP的RPE细胞。Western blot检测显示，随电压增加，EGFP蛋白与β-肌动蛋白条带灰度相对比值呈上升趋势。RTPCR检测显示，各组均产生阳性扩增条带，随电压增高，EGFP mRNA与GADPH mRNA扩增条带灰度相对比值逐渐增高。结论在体电穿孔方法可以有效辅助基因转染大鼠RPE细胞层。
- 张萌莫晓芬郭文毅吴继红方媛张圣海李希
- 关键词：色素上皮视网膜炎电穿孔光感受器
- 电穿孔辅助bFGF基因转染视网膜神经节细胞层延缓RCS大鼠视网膜色素变性
- 2009年
- 目的以遗传性视网膜色素变性RCS大鼠为模型,探讨在体电穿孔辅助碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因转染视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)层治疗视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)的可行性。方法将编码bFGF的质粒注射至RCS大鼠右眼玻璃体腔内,左眼注射TE buffer作为对照,随即以在体电穿孔法辅助基因转染。于1周后采用Western blot、逆转录聚合酶链反应(re-verse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)半定量观察bFGF的表达,术后1、2、3、4周于光学显微镜下观察视网膜外核层的变化,术后1周用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡情况。结果术后1、2、3、4周基因治疗眼视网膜外核层较同期对照眼厚度增加,存活的光感受器数量较对照眼多(P<0.05)。Western blot、RT-PCR可见bFGF蛋白和mRNA的表达。TUNEL结果显示对照眼和治疗眼外核层阳性细胞凋亡指数分别为33.58%±3.72%、12.42%±2.83%,治疗眼TUNEL阳性细胞数较对照眼明显减少(P<0.05)。结论在体电穿孔辅助bFGF基因转染RGC层能够延缓RCS大鼠视网膜色素变性的病程。
- 张萌莫晓芬郭文毅董京艳吴继红方媛张圣海李希
- 关键词：电穿孔碱性成纤维细胞生长因子视网膜神经节细胞视网膜色素变性
