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A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测被引量：2: 2012年; 目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在103～107拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。; 王春晖赵素慧韦耀周莹万成松; 关键词：肉毒梭菌 TAQMAN探针荧光定量PCR

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化: 2012年; 目的制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157:H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86(0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157:H7EspF蛋白的抗血清效价达1:2048000;该血清对EHECO157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157:H7EspF蛋白多克隆抗体。; 周莹赵素慧韦耀王春晖张其威万成松; 关键词：O157:H7 多克隆抗体

A型肉毒毒素(BoNT/A)表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定被引量：2: 2013年; 目的获得高效价A型肉毒毒素（BoNT／A）表位多肽单克隆抗体。方法利用DNASTAR分析软件，结合Expasy网络服务器，综合参考多参数预测B细胞抗原表位；以多肽作为抗原制备BoNT／AHc表位多肽单克隆抗体，并进行效价鉴定。结果以合成多肽（P1＆P2）分别免疫Balb／c小鼠，获得两株单克隆抗体，经鉴定分别是IgG和IgM，效价为10-5～10-6；检测抗体结果显示，纯度较高，特异性好。结论本研究制备出了特异性好、效价较高的A型肉毒毒素单克隆抗体，为获得抗A型肉毒毒素的快速现场检测提供技术支持。; 韦耀韩朋周旋孙琦张宝万成松; 关键词：A型肉毒毒素单克隆抗体效价

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌被引量：3: 2012年; 目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。; 赵素慧王春晖周莹韦耀韩桂圆钮红岺赵卫张其威万成松; 关键词：土拉弗朗西斯菌 TAQMAN探针荧光定量PCR

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广东省社会发展领域科技计划项目(2010B031000005)