国家重点基础研究发展计划(2007CB512803)
- 作品数：23 被引量：141H指数：8
- 相关作者：徐东平刘妍许智慧李晓东任晓强更多>>
- 相关机构：解放军第302医院解放军302医院内蒙古农业大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家科技重大专项北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 乙型肝炎病毒基因突变与重型肝炎/肝衰竭发生的关系被引量：20
- 2008年
- 乙型肝炎重症化导致的重型肝炎或肝衰竭在临床上病情危重、发展迅速、病死率很高,但发病机制尚不完全明了。HBV基因突变导致病毒生物学特性改变是影响HBV感染转归的重要因素之一。本文就HBV基因突变与重型肝炎/肝衰竭发生的相关研究进展作一综述。
- 李梵王慧芬徐东平
- 关键词：乙型肝炎病毒基因突变重型肝炎肝衰竭
- 滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用被引量：15
- 2009年
- 目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。
- 任晓强苏何玲邹正升高峰刘立明刘妍李保森徐东平钟彦伟
- 关键词：滚环扩增共价闭合环状DNA
- G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究被引量：6
- 2010年
- 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBVCP变异对下游基因转录活性的影响。方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVCP片段,克隆至pGEM-TEasy载体。挑选含有CP相关变异位点的质粒,经KpnⅠ/BglⅡ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测。结果患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05)。细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍。结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBVCP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用。
- 王耀刘妍许智慧纪冬李晓东钟彦伟徐东平
- 关键词：突变启动区反式激活
- 限制性片段长度多态性分析法在CXCL10 G-201A位点变异检测中的应用被引量：1
- 2011年
- 目的通过检测慢性乙型肝炎重型(chronic severe hepatitis B,CSHB)患者趋化因子CXCL10[干扰素γ诱导蛋白(IFN γ-inducible protein,IP-10)]基因启动子区G-201A位点的变异率,探讨PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)法用于批量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型鉴定的应用价值。方法选取解放军第三〇二医院的200例CSHB患者(CSHB组)为研究对象,300例健康体检者作为正常对照(normal control,NC)组。收集患者EDTA-K2抗凝全血,提取白细胞DNA,采用PCR-RFLP法进行检测,对其中185例[CSHB组93例(46.5%),NC组92例(30.7%)]样本(占总样品的37%)用DNA测序法进行验证。结果 185例样本用DNA测序法进行验证,经Kappa检验k=0.937,P<0.05,说明二种检测结果之间的一致性具有统计学意义,二种方法的一致率为97.84%,符合体外诊断试剂临床试验指导方案中关于二种方法一致性的专业要求(一致率≥95%)。CSHB组趋化因子IP-10相关的G-201A的突变率为21.28%、NC组为13.82%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CSHB组患者的趋化因子IP-10基因启动子区G-201A位点的突变率明显高于NC组。本实验结果表明,PCR-RFLP法经过直接测序法验证结果可靠,可以用于标本的SNP分型。
- 刘立明许智慧刘妍谢红王海滨毛远丽徐东平
- 关键词：趋化因子类乙型多态现象单核苷酸多态现象限制性片段长度
- 1例多药耐药慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因突变的5年动态分析被引量：8
- 2008年
- 目的动态检测乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因和前C及基本核心启动子（BCP）区基因突变，分析基因突变与核苷（酸）类似物耐药、HBeAg阴转的关系。方法收集1例在我院14次住院治疗患者血清18份，提取DNA，采用巢式PCR法扩增HBV靶基因片段，对PCR产物进行DNA双向测序，NTI软件对比分析结果，分析逆转录酶基因12个耐药位点和前C／BCP区6个位点上的突变情况，结合临床资料解析突变意义。结果先后检测到了引起拉米夫定耐药的M204I／V共生突变、L180M＋M204V突变，引起恩替卡韦耐药的S202G突变，以及引起HBeAg阴转的G1896A突变，检测结果与临床病情发展情况符合。结论采用DNA序列测定方法可以全面了解HBV基因突变，有助于临床监测病情发展，合理进行抗病毒治疗。
- 李晓东王琳李梵貌盼勇王慧芬徐东平
- 关键词：肝炎病毒乙型耐药
- 1740例慢性乙型肝炎患者替诺福韦酯耐药可能相关突变分析被引量：7
- 2009年
- 目的通过大样本测序分析慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV反转录酶(reverse transcriptase,RT)序列,明确与替诺福韦酯(TDF)耐药可能相关的突变在我国患者未使用该药前的检出状况,预测TDF在我国临床的应用前景。方法收集1740例CHB患者血清,提取血清中HBVDNA,采用巢式PCR方法扩增HBVRT基因,对PCR产物进行DNA测序,NTI软件比对结果。检测与核苷(酸)类似物耐药相关的RT区12个位点序列,重点分析了与TDF临床耐药可能相关的A194T突变以及体外证实可降低TDF活性的V214A、Q215S和A181V+N236T突变。结果540例(31%)患者分别检出了与拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)耐药相关突变;未检出A194T突变;34例(2.0%)患者检出V214A突变;3例(0.2%)检出Q215S突变;15例(0.9%)检出A181V+N236T(其中3例为A181V/T+N236T)突变。结论未检出与TDF临床耐药可能相关的A194T突变,提示目前我国CHB患者自然发生或应用核苷(酸)类似物后引起的TDF原发耐药的可能性很小,预测该药在我国治疗对目前四种抗HBV核苷(酸)类似物耐药的患者应具有较好疗效,但V214A和A181V+N236T突变是否影响TDF临床疗效仍值得关注。
- 梁兆玲刘妍苏何玲孟玉华罗莉蓉王静戴久增姚增涛徐东平
- 关键词：慢性乙型肝炎突变耐药替诺福韦酯
- 慢性乙型肝炎患者HBV核心区与聚合酶区特异性CTL表位变异分析被引量：1
- 2011年
- 目的比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎与慢性重型乙型肝炎患者HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位变异的差异,以探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理。方法对516例乙型肝炎患者的血清进行HLA-A2和A11分型;用巢式PCR扩增血清HBV C基因与Pol基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的HLA-A2限制性的4个C蛋白和5个Pol蛋白特异性CTL表位与HLA-A11限制性的1个C蛋白表位进行序列分析。结果 247例(47.86%)患者HLA-A2阳性,其中AHB 67例,CHB 109例,CSHB 71例;220例(42.64%)患者HLA-A11阳性,其中AHB 67例,CHB 107例,CSHB 46例;CTL表位变异分析结果如下:①在3组HLA-A2阳性患者,表位变异发生率无显著性差异(P>0.05);②在三组HLA-A2阳性HBV B基因型患者,P455-463和P816-824表位变异有极显著性差异(P<0.01);③在三组HLA-A2阳性HBV C基因型患者,各表位变异无显著性差异;④在三组HLA-A11阳性患者,C88-96表位变异发生率有显著性差异(P<0.05),三组HBV C基因型患者,表位变异发生率有极显著性差异(P<0.01),而在HBV B基因型患者,各表位变异无显著性差异(P>0.05)。结论某些HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位在AHB、CHB和CSHB患者间变异有明显差异,并且受感染病毒基因型的影响。CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。
- 许智慧任晓强刘妍李晓东王耀戴久增徐东平
- 关键词：乙型肝炎乙型肝炎病毒核心蛋白
- 趋化因子CXCL10 G-201A单核苷酸多态性与HBV感染慢性化和重症化关系的研究被引量：8
- 2011年
- 目的检测趋化因子CXCL10(IP-10)启动子区G-201A位点的单核苷酸多态性(SNP),探讨其与乙型肝炎病毒(HBV)感染慢性化及重症化的关系。方法采集302医院792例HBV感染患者血样,包括急性乙型肝炎(AHB)200例、轻中度慢性乙型肝炎(CHB-M)200例、重度慢性乙型肝炎(CHB-S)192例和慢加急肝衰竭(ACLF)200例,另采集300各正常人(NC)血样作为对照。提取DNA,PCR扩增与G-201位点变异连锁的C-1596区域片段,进行限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析;同时从各组随机抽取400例样本,采用PCR产物直接测序法进行G-201位点区域片段的测序分析。对上述两种方法SNP分型结果的一致性进行分析。结果 G-201A的变异率为:AHB组17.77%,CHB-M组25.26%,CHB-S组26.59%,ACLF组21.28%,NC组13.82%,各组间总P=0.0037;相关性检验(P=0.0015)表明变异率与不同病程相关;经线性趋势检验,P=0.0029,Z=—2.9748,表明变异率随疾病进展呈现升高趋势。各组间两两比较发现,CHB-M、CHB-S、ACLF组与NC组之间的变异率有显著差异(P值分别为0.0024、0.0007、0.0428);CHB-S组与AHB组之间的变异率有显著差异(P=0.0488)。PCR产物直接测序法与PCR-RFLP法检测结果的一致率为98.68%,Kappa检验得出U=58.425,P<0.05,检测结果之间的一致性符合统计学要求。结论 IP-10启动子区G-201A变异与HBV感染慢性化相关,其与HBV感染重症化的关系尚需进一步研究。
- 刘立明许智慧刘妍钟彦伟毛远丽王海滨王慧芬徐东平
- 关键词：趋化因子CXC单核苷酸多态性乙型
- 乙型肝炎患者HBV前S/S抗原特异性变异表位亲和力分析被引量：1
- 2010年
- 目的比较慢性乙型肝炎(CHB)和慢性重型肝炎(CSHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位变异发生率差异和亲和力变化,探讨HBV感染的发病机制。方法对2007年8月-2008年12月解放军302医院收治的385例乙型肝炎患者(CHB109例,CSHB71例)样本进行型特异性PCRHLA-A2分型;对HBV前S/S基因进行PCR产物直接测序,分析13个HLA-A2限制性前S/S蛋白中的特异性CTL表位序列,并用分子进化树进行HBV基因分型;通过BIMAS程序预测和T2细胞结合实验分析表位变异对CTL亲和力的影响。结果 HLA-A2阳性患者180例(46.8%);HBVC基因型感染138例,其中CHB患者86例、CSHB患者52例。CHB和CSHB患者的S177-185、S204-212、S131-139、S183-191表位变异发生率有显著差异(P<0.01或P<0.05)。BIMAS分析显示S204-212、S131-139和S183-191的表位变异形式对CTL结合的亲和力与未变异表位形式相比明显降低。T2细胞结合实验证实S131-139变异表位的亲和力较未变异表位降低了1.83倍。结论某些HBV前S/S抗原特异性CTL表位的变异发生率在同为C基因型感染的CHB和CSHB患者间有明显差异;表位变异可引起对CTL的亲和力改变从而影响机体对HBV感染的免疫应答。
- 孙志强许智慧任晓强刘妍王耀李晓东毛远丽徐东平
- 234例慢性乙型肝炎患者HBV前C/BCP区突变分析被引量：8
- 2009年
- 目的调查慢性乙型肝炎患者血清HBV前C/基本核心启动子(BCP)区的突变情况,分析各种突变对HBeAg表达的影响。方法抽提患者血清DNA,采用改进的巢式PCR技术,扩增HBV前C/BCP区基因,对PCR产物进行DNA测序。用NTI软件比对结果,根据文献报道,选取1753、1762、1764、1862、1896和1899共6个位点进行突变分析,并重点分析不同突变对患者血清HBeAg阳性率和病情的影响。结果在234例中6个位点均无突变者为74例(31.6%),其血清HBeAg阳性率为74.3%(55/74)。在234例中6个位点检出至少1种突变的病例为160例(68.4%),突变形式包括4种单一位点突变和21种组合形式的突变;检出G1896A突变73例(31.2%),其中36例检出有共存未突变序列,37例仅检出突变序列,后者血清HBeAg的阳性率为18.9%(7/37)。检出G1896A以外其他形式突变的有87例,HBeAg阳性率为63.2%(55/87);其中以A1762T+G1764A最为常见,HBeAg阳性率为69.4%(34/49)。在1753、1862位点上检出4种特殊碱基突变,前C区有基因片段插入或缺失的有2例。结论多数慢性乙型肝炎患者在HBV前C/BCP区可检出突变,突变形式多样,其中G1896A突变样本血清HBeAg阳性率显著下降,而其他突变对其影响较小。应用DNA序列测定法分析HBV前C/BCP区基因突变,获得的信息全面,对临床评估病情进展和实施抗病毒治疗有参考价值。
- 白丽王琳李乐孟玉华万芃瑾刘晓红陈雪源张玲霞徐东平
- 关键词：乙型肝炎HBEAG基因测序
