国家自然科学基金(31100121)
- 作品数：7 被引量：18H指数：3
- 相关作者：童光志姜一峰周艳君童武徐彦召更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所华中农业大学河南科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划上海市科技兴农重点攻关项目更多>>
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- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析被引量：3
- 2012年
- 为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。
- 姜一峰周艳君王亚欣朱建平徐彦召童武虞凌雪童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究被引量：4
- 2013年
- 建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据。本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+E2。用限制性内切酶SwaΙ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒。分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列。间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传。病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。
- 徐彦召周艳君童武李玲姜一峰童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒载体
- 猪繁殖与呼吸综合征基因标记疫苗株NP49-ELISA鉴别诊断方法的建立被引量：1
- 2013年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)rHN4-Δ25+NP49株是新型基因标记弱毒疫苗候选株,为了配合对该基因标记疫苗免疫猪血清抗体的鉴别诊断,本研究以标记基因编码的NP49(新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸,即NP49)多肽作为包被抗原,建立标记疫苗免疫猪血清中NP49抗体的ELISA鉴别诊断方法。通过对NP49-ELISA工作条件的优化,结果显示NP49-ELISA的多肽抗原最适包被浓度为500 ng/孔,被检血清最佳稀释度为1:40。利用ROC曲线法确定S/P临界值为0.2,该方法批内与批间重复试验的变异系数均小于10%,与几种常见猪病阳性血清无交叉反应,具有较好重复性和特异性。本研究建立的NP49-ELISA鉴别诊断方法为猪繁殖与呼吸综合征新型基因标记疫苗的临床应用提供了有力保障。
- 孙晶周艳君徐彦召姜一峰童武童光志
- 关键词：多肽抗原
- 表达O型口蹄疫病毒保护性抗原表位重组PRRSV的构建及其鉴定被引量：5
- 2012年
- 以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆（rHuN4-F112）作为载体，将O型口蹄疫病毒（FMDV）VPl基因的421～480nt（141～160aa）和598～639nt（200～213aa）两优势保护性抗原表位串联成的目的基因，通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508～532位缺失区域，经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36h，将上清接种至MARC-145细胞中培养，并在MARC-145细胞中连续传代，拯救重组病毒。经RT-PCR扩增，MluI酶切及测序验证，结果表明插入的外源基因及人为突变的Mlu1分子标记都正确，说明重组病毒拯救成功，且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代，将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O／VPlep。rPRRsv-F112-O／VPlep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变，间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析，该病毒的TCID50=-log10-6.75／0．1mL，且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-Fll2（△508-532）相似，但明显高于rHuN4-F112病毒。
- 童武徐彦召周艳君姜一峰张善瑞王亚欣朱建平虞凌雪孙晶陈焕春童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒O型口蹄疫病毒感染性分子克隆重组病毒
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SHxx13/2013株的分离与鉴定被引量：1
- 2014年
- 2013年初上海某猪场保育猪群中出现高热、呼吸障碍等临床表现,导致大部分发病猪死亡,为了确定此次猪群中爆发疫病的病原,本研究从发病猪群中随机采集了15份血液样品,利用RT-PCR方法对本次疫病病原进行了检测。结果显示,有11份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强阳性,且与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)对照大小相一致。随后从阳性样品中选取SHxx13/2013在Marc-145细胞中进行病毒的分离与鉴定,结果显示SHxx13/2013在细胞接种后第1代即出现明显的细胞效应(cytopathic effect,CPE),其病变特征与高致病性PRRSV强毒HuN4株一致。对SHxx13/2013第5代细胞分离毒进行RT-PCR和IFA等特异性鉴定,结果显示该毒株为PRRSV分离株,其蚀斑形态和生长特性与强毒HuN4株相似。分段克隆该毒株全长基因进行测序和序列分析,结果显示,新分离的流行毒SHxx13/2013株全长基因组为15 319 bp,其Nsp2基因特征与HP-PRRSV一致,在第482位和第534~562位发生两处共30个氨基酸的不连续缺失,且该毒株与高致病性PRRSV代表毒株HuN4亲缘关系较近,全长基因的核苷酸同源性为99.6%。本研究结果表明新分离的SHxx13/2013株属于高致病性PRRSV分离株,据此我们推测今年年初上海某猪场爆发的疫情主要是由HP-PRRSV感染所致。
- 程群姜一峰虞凌雪王康杨莘李丽薇高飞于海童武童光志周艳君
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株最小免疫剂量的测定
- 2014年
- 将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。
- 姜一峰周艳君童武虞凌雪程群杨莘夏天奇李丽薇高飞童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒最小免疫剂量
