国家自然科学基金(30471515)
- 作品数：14 被引量：52H指数：4
- 相关作者：殷旭仁余传信高琪梁幼生华万全更多>>
- 相关机构：江苏省血吸虫病防治研究所南昌大学长崎大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省医学重点人才培养基金江苏省科技厅公益专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA文库的构建及初步筛选被引量：3
- 2007年
- 目的建立日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA(SST-cDNA)文库,筛选日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。方法抽提日本血吸虫童虫mRNA,并转录合成cDNA。将纯化的cDNA插入到载体pAPtag2中,构建SST-cDNA文库。将cDNA文库质粒转染到COS7细胞中进行蛋白表达,通过检测转染细胞中胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的活性来判定插入的血吸虫童虫cDNA片段中是否带有信号序列。测定阳性克隆中外源性cDNA的核苷酸序,并通过Blast与Gen-Bank、EST数据库进行比对确定其性质。采用快速扩增cDNA未端序列方法获得基因的全长cDNA序列。用SignalP3.0、TMPred、TargetP服务器对带有信号序列基因的特征进行分析和预测。结果日本血吸虫童虫cDNA被插入到真核表达载体pAPtag2中,成功构建日本血吸虫童虫SST-cDNA文库。限制性内切酶分析表明SST-cDNA文库的容量为5×106cfu。SST-cDNA文库质粒转染到COS7细胞中后,通过近缘筛选获得21个带有信号肽cDNA序列,其中4个为未知新基因序列,5个为已知功能基因,12个与血吸虫EST序列同源。获得了8个基因的全长cDNA序列,演绎氨基酸序列特征分析表明,其中5个为膜结合蛋白基因,3个为外分泌蛋白基因。结论本研究成功构建了日本血吸虫童虫SST-cDNA文库,初步筛选获得了8个带信号肽的外分泌或膜结合蛋白分子基因。
- 余传信殷旭仁李健许永良周永华高琪梁幼生
- 关键词：血吸虫膜蛋白
- 重组日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团对小鼠免疫保护作用的研究被引量：2
- 2009年
- 目的探讨重组日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团融合蛋白(GST-TSP2HD)抗血吸虫感染免疫保护效果。方法采用Glutathione sepharose 4B胶亲和层析法大量制备GST-TSP2HD蛋白。实验组以GST-TSP2HD融合蛋白的福氏佐剂抗原免疫C57BL/6J小鼠,同时设置佐剂对照组及GST蛋白免疫对照组,每2周加强免疫1次。加强免疫2次后每只小鼠经腹部皮肤感染(45±2)条血吸虫尾蚴。感染42 d后剖杀小鼠,经生理盐水静脉灌注收集成虫,计数减虫率,用KOH溶液消化肝组织收集虫卵,计算减卵率。组织切片观察小鼠肝组织病理变化,通过酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中的抗体水平。结果与佐剂对照组相比,GST-TSP2HD融合蛋白免疫组的减虫率为27.10%,减卵率为32.30%;与GST蛋白免疫组相比,GST-TSP2HD融合蛋白免疫组可获得39.57%的减虫率,43.53%的减卵率。GST-TSP2HD融合蛋白免疫组肝组织中的虫卵肉芽肿数量明显减少,单个虫卵肉芽肿平均直径比佐剂对照组、GST蛋白免疫组分别下降了27.08%(P<0.05)和40.53%(P<0.01),差异均有统计学意义。GST-TSP2HD能诱导高水平抗TSP2HD蛋白的特异性抗体IgG,其中IgG1、IgG2b和IgG2c亚类可能在小鼠抗血吸虫感染保护性免疫中发挥重要作用。结论日本血吸虫四跨膜蛋白是一个有效的日本血吸虫病疫苗候选分子。
- 余传信殷旭仁李健吴宇迪华万全梁幼生高琪
- 关键词：日本血吸虫免疫小鼠
- 低剂量环磷酰胺对血吸虫感染小鼠的影响
- 2009年
- 目的探讨使用低剂量环磷酰胺对血吸虫感染免疫的影响。方法小鼠经腹腔注射低剂量环磷酰胺(50mg/kg),在体内创造并维持一个Th1型免疫环境。观察小鼠外周血、脾脏调节性T细胞水平及血清细胞因子的动态变化。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测经环磷酰胺处理的调节性T细胞上Foxp3基因表达水平。用(30±1)条血吸虫尾蚴感染处于Th1型免疫反应状态小鼠,42d后剖杀,计算减虫率、减卵率,通过组织切片观察小鼠肝脏组织病理变化。结果低剂量环磷酰胺可以降低小鼠外周血、脾脏中的调节性T细胞水平,并下调Foxp3的表达,使小鼠血清IL-2、IFN-γ上升,IL-4、IL-10及TGF-β水平下降,免疫反应向Th1型转变。与对照组相比,用药组的血吸虫虫卵产量明显下降,小鼠肝脏虫卵肉芽肿病变明显减轻。结论低剂量环磷酰胺可调节小鼠的免疫反应朝Th1发展,可以降低血吸虫虫卵产量,并减轻肝脏虫卵肉芽肿病变。
- 余传信吴宇迪王玠殷旭仁华万全许永良梁幼生高琪
- 关键词：日本血吸虫环磷酰胺肉芽肿小鼠
- 环介导同温DNA扩增技术鉴定血吸虫感染性钉螺方法的建立被引量：24
- 2008年
- 目的建立一种快速鉴定血吸虫感染性钉螺的环介导同温DNA扩增方法。方法选择一个高拷贝的日本血吸虫基因SjR2的部分DNA序列作为扩增靶位,根据环介导同温DNA扩增原理设计合成引物,建立扩增该片段的环介导同温DNA扩增方法。使用此方法与聚合酶链反应(PCR)方法同时检测血吸虫感染性钉螺与正常钉螺的DNA,观察其应用价值。结果日本血吸虫SjR2基因的839～1 138 bp区段被成功扩增和克隆。利用根据该片段DNA序列设计合成的环介导同温DNA扩增反应的引物,成功地建立了能扩增该片段的环介导同温DNA扩增方法,其敏感性高于PCR法,能检出1 pg的血吸虫DNA。用此法检测30只感染性钉螺,阳性率为93.33%,而PCR的阳性率83.33%,两者差异有统计学意义(P<0.01)。结论环介导同温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺具有较高的敏感性,是一种潜在有效的血吸虫感染性钉螺鉴定方法。
- 余传信殷旭仁华万全高琪
- 关键词：感染性钉螺
- 日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析被引量：1
- 2006年
- 目的对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板,采用套式PCR,快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5′、3′末端片段,将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5′、3′末端片段序列进行比对和拼接,构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列,对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段,其中16个片段的5′、3′末端cDNA序列被成功扩增,并测定了它们的DNA序列,通过序列比对和拼接,获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析,发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同,而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似,从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明,基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接(alternativesplicing)方式进行拼接;而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列,虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。
- 余传信殷旭仁菊池三惠子平山谦二朱荫昌
- 关键词：日本血吸虫基因克隆全长CDNA序列
- 日本血吸虫感染小鼠调节性T细胞水平动态变化及功能逆转研究被引量：1
- 2009年
- 目的观察日本血吸虫感染小鼠调节性T细胞水平动态变化,筛选调节性T细胞功能抑制因子。方法以日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采用流式细胞分析法检测不同感染阶段小鼠体内调节性T细胞水平;通过检测小鼠血清中细胞因子的水平变化,观察免疫反应的极化过程;采用磁珠分离法纯化小鼠脾脏的调节性T细胞,人工设计合成2条寡核苷酸(CpG1-ODN,CpG2-ODN),通过淋巴细胞增殖试验筛选能逆转调节性T细胞功能的刺激因子。结果流式细胞分析发现,随着血吸虫感染进程的发展,小鼠外周血及脾脏调节性T细胞水平逐渐增加,免疫反应逐步向Th2型极化,血清IL-5水平增加,IFN-γ下降。淋巴细胞增殖试验显示,人工合成的寡核苷酸(CpG2-ODN)能有效刺激淋巴细胞增殖,使淋巴细胞的IL-2分泌增加,TGF-γ下降,并能解除调节性T细胞对效应T细胞增殖的免疫抑制作用。结论血吸虫感染可增加小鼠体内调节性T细胞水平,诱导免疫反应向Th2型极化。寡聚核苷酸CpG2-ODN能逆转调节性T细胞的免疫抑制功能。
- 余传信吴宇迪王玠殷旭仁华万全钱春艳梁幼生高琪
- 关键词：调节性T细胞逆转
- 日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因克隆和序列分析被引量：4
- 2008年
- 目的克隆日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)基因,并进行序列分析。方法制备日本血吸虫成虫mRNA,反转录合成cDNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出SjTGR基因片段。通过TA克隆技术将该基因片段克隆到pGEM-T载体中进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果采用PCR技术成功地从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出TGR基因片段,TA克隆后DNA序列分析显示该基因长度为1791bp,编码596个氨基酸残基,理论分子质量65kDa,生物信息学分析显示与曼氏血吸虫TGR氨基酸序列同源性为82%,含有吡啶核苷酸二硫化物氧化活性中心CVNVGC序列,在氨基端含有谷氧还蛋白特征性的活性位点CPFC基序。结论SjTGR基因克隆获得成功,为发展抗日本血吸虫新药及疫苗候选分子奠定了基础。
- 谢曙英殷旭仁华万全曾小军陈红根梁幼生高琪余传信
- 关键词：日本血吸虫基因克隆
- 日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白基因的克隆表达与功能分析
- 2014年
- 目的克隆、表达日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白(SjHMGB1),并研究其功能特性。方法利用逆转录PCR(RT-PCR)技术从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增出编码SjHMGB1的完整开放阅读框DNA片段,然后将其亚克隆至原核表达载体质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒SjHMGB1-pET28a。将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),含重组质粒的转化子细菌经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导以表达重组SjHMGB1蛋白。通过镍螯合琼脂糖亲和胶亲和层析法制备纯化的重组SjHMGB1蛋白。通过DNA迟滞实验和动物免疫鉴定重组SjHMGB1的DNA结合和免疫学特性。通过免疫印迹试验(Western blotting)和RT-PCR确定SjHMGB1分子在日本血吸虫不同发育阶段的表达情况。以重组SjHMGB1为抗原免疫小鼠,3次免疫后每只小鼠感染45±2条血吸虫尾蚴,42 d后剖杀,计算减虫率与减卵率,观察其诱导抗血吸虫感染的免疫保护性作用。结果采用RT-PCR法从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增到长度约为530 bp的特异性DNA条带,序列分析证实为编码SjHMGB1蛋白的开放阅读框序列。将此片段亚克隆至表达质粒pET28a(+)中,成功构建了重组表达质粒SjHMGB1-pET28a。含重组表达质粒SjHMGB1-pET28a的转化子细菌经IPTG诱导能表达分子量约28 kDa的可溶性SjHMGB1蛋白。采用镍螯合亲和层法制备了纯化的重组SjHMGB1蛋白。DNA迟滞试验显示纯化的Sj HMGB1蛋白可同超螺旋及线性DNA结合,重组SjHMGB1免疫小鼠能产生高效价的抗体IgG,Western blotting分析证实重组SjHMGB1蛋白能被重感染小鼠血清所识别,表明重组表达的SjHMGB1分子具有天然蛋白的功能活性与免疫学特性。RT-PCR和Western blotting分析显示SjHMGB1分子在血吸虫成虫和虫卵期大量表达,而在尾蚴阶段表达量极低。免疫保护性试验结果表明,重组SjHMGB1分子免疫不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。结论获得了编码SjHMGB1基因和纯�
- 姚媛余传信宋丽君殷旭仁王玠金一沈双张伟高玒许永良杨静
- 关键词：日本血吸虫DNA结合活性免疫保护作用BOX
- 日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因合成、表达与免疫原性研究被引量：5
- 2008年
- 目的合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因,并研究其免疫原性。方法采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD(aa107～aa182)完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化大肠埃希菌BL21(DE3),获得含重组表达质粒的转化子,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察TSP2HD融合蛋白表达情况。用谷胱甘肽(GST)融合蛋白纯化胶(glutathione sepharose 4B)从表达产物裂解上清中纯化GST-TSP2HD融合蛋白,用凝血酶切割融合蛋白,制备纯化的重组TSP2HD蛋白。通过蛋白质印迹(Western blotting)分析重组TSP2HD蛋白与血吸虫病患者血清及血吸虫重感染兔血清的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白刺激血吸虫感染小鼠淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,通过比较实验组与对照组脉冲指数(cpm)值的差异研究重组TSP2HD蛋白的免疫原性。结果经过3轮重叠PCR扩增,获得长228bp的TSP2HD基因,序列分析证实与天然基因序列完全一致。含重组质粒TSP2HD-PG的转化子细菌,经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为34000的可溶性GST-TSP2HD融合蛋白。凝血酶切割GST-TSP2HD融合蛋白获得纯化的重组TSP2HD蛋白。Western blotting分析证明,重组表达蛋白可被血吸虫重感染兔血清和血吸虫病患者血清识别,有较好的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白能刺激血吸虫感染小鼠脾细胞增殖,实验组cpm值明显高于对照组,两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论日本血吸虫TSP2HD基因合成及表达获得成功,重组TSP2HD蛋白有天然免疫原性。
- 余传信李健殷旭仁华万全梁幼生高琪
- 关键词：日本血吸虫重叠PCR基因合成免疫原性
- 诱导T细胞免疫反应的日本血吸虫抗原表位的重组表达与免疫原性鉴定
- 2007年
- 目的对预测的日本血吸虫T细胞免疫反应表位进行合成与融合表达,并对其免疫原性进行分析。方法根据3个表位(P7、P17、P18)的基因序列,人工合成正、负链寡核苷酸序列,使正链的5′端带有NcoI酶切位点,负链的3′端带有XhoI酶切位点。将每条表位肽的正、负寡核苷酸链退火形成双链DNA后,定向克隆入表达载体pET32c(+),电转化至E.coliDH5α,经PCR、酶切及DNA序列分析鉴定出分别含有P7、P17、P18序列的重组质粒。提取重组质粒电转化至E.coliBL21(DE3)中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷对表位肽融合蛋白进行诱导表达,经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析。表位肽融合蛋白用Ni2+螯合亲和层析胶纯化。同时根据P7、P17及P18的氨基酸序列人工合成这3个表位肽段。用纯化的表位融合蛋白、人工合成的表位肽体外刺激紫外线致弱尾蚴免疫C57BL/6J小鼠脾细胞,3H-TdR掺入法检测其刺激淋巴细胞的增殖效果。结果P7、P17、P183个表位肽基因序列被成功克隆到pET32c(+)中并获得重组质粒,重组质粒均能表达大小约20kDa的融合蛋白。表达产物用Ni2+亲和层析胶纯化后获得纯化的肽融合蛋白。表位P7、P17重组蛋白或合成肽均能有效刺激小鼠淋巴细胞增殖。结论P7、P17肽段是日本血吸虫的T细胞抗原表位。
- 李健殷旭仁余传信许永良华万全何伟梁幼生高琪
- 关键词：日本血吸虫抗原表位
