国家自然科学基金(30371275)
- 作品数：6 被引量：14H指数：2
- 相关作者：尹一兵王虹吴凯峰张雪梅尹楠林更多>>
- 相关机构：重庆医科大学重庆医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 定量PCR的荧光技术被引量：9
- 2005年
- 荧光定量PCR是在普通PCR基础上,利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术,其灵敏度高、特异性高、操作简便和定量准确,已被广泛应用于临床和科研中。为更好地发挥荧光定量PCR的优点,荧光技术领域的研发工作十分活跃。
- 许颂霄王虹尹一兵
- 关键词：荧光定量PCR荧光探针
- 操纵子comCDE调控肺炎链球菌转化的分子机制研究
- 2009年
- 目的:探讨操纵子comCDE对调控肺炎链球菌转化的分子机制。方法:将D39野生菌株与comE基因缺陷菌株(△comE)分别用感受态刺激因子(Competence-stimulating peptide,CSP)诱导转化,记录不同时间点的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRNA表达水平,并通过双向电泳及图像分析比较CSP诱导后不同时间点的蛋白质表达谱差异及野生菌株与△comE菌株的蛋白质表达谱差异。结果:D39菌株在CSP诱导后不同时间点都能发生转化,其中0 min时转化率最高,其comE的mRNA表达量在CSP诱导10 min后表达显著增加,20 min时迅速回落(P<0.05)。△comE菌株不能被CSP诱导发生转化。蛋白质组学研究显示,△comE菌株有6个蛋白较D39菌株的表达量显著增加;CSP诱导10 min时有6个蛋白表达显著增加,而在20 min时又迅速回落;二者有2个蛋白相同;有1个蛋白在加入CSP后表达显著降低。结论:基因comE的存在是CSP诱导转化必需的,CSP诱导转化可能有非comE依赖途径,而comE可能有除转化以外调控功能,且不依赖于CSP。
- 袁泰先朱兴华吴凯峰尹楠林胥文春王虹尹一兵张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌双向凝胶电泳
- 肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化被引量：5
- 2008年
- 目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90%以上。
- 袁军陈曜曹炬尹一兵
- 关键词：毒力因子肺炎链球菌
- comE基因的表达水平与肺炎链球菌的转化率相关性研究
- 2009年
- 目的:探讨肺炎链球菌感受态形成关键基因comE的表达对肺炎链球菌转化的影响.方法:构建肺炎链球菌基因comE的缺陷菌株,将野生菌株与缺陷菌株分别进行自然转化和感受态刺激因子(CSP)诱导转化,记录不同时间段的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRNA表达水平.结果:comE基因缺陷菌株的自然转化和CSP诱导转化率都为0,且检测不到comE的mRNA表达.R6野生菌株的自然转化率在细菌密度A550 nm为0.3左右时最高,comEmRNA的表达水平与其转化率的相关系数为0.244.D39在不同浓度CSP的诱导下都能发生转化,但CSP浓度为100μg/L时的转化率高于10,1000μg/L两个诱导浓度.100μg/L CSP诱导10 min时comEmRNA的表达量较基础水平显著增高(P<0.05).10,1000μg/L CSP诱导时,其不同时间comEmRNA的表达量与其转化率相关性差.100μg/L CSP诱导时,其转化率与0,20 min时comEmRNA表达量的相关系数分别为0.9966和0.9984;与10 min时comEmRNA表达量的相关系数为0.7950.结论:不管是自然转化还是CSP诱导转化,comE的表达都是必需的,但其表达水平与细菌的自然转化率无显著相关性.CSP诱导转化的最佳浓度为100μg/L,此时的转化率与comEmRNA的基础表达量显著相关,而在10,1000μg/L的CSP诱导时不存在这种相关性.
- 朱兴华吴凯峰尹楠林庞丹胥文春王虹尹一兵张雪梅
- 关键词：链球菌肺炎COME实时荧光定量聚合酶链反应
- 肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性
- 2009年
- 目的:构建含有肺炎链球菌(SPN)毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法:PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果:CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论:成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.
- 陈怡婷陈大鹏曹炬吴凯峰尹楠林尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌DNA疫苗免疫应答
- 肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究
- 2004年
- 目的 :galU基因是肺炎链球菌荚膜合成的关键基因 ,构建该基因的缺失突变体 ,获得肺炎链球菌荚膜缺陷菌株 ,研究其生物学功能 ,并为肺炎链球菌功能基因组研究提供实验菌株和技术平台 .方法 :采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH PCR)方法制备中间为红霉素耐药基因 (erm ) ,两侧为galU基因上、下游同源序列的连接片段 ,并将此片段转化入肺炎链球菌 ,在含红霉素的血平板上筛选出缺陷菌株 .用PCR鉴定缺陷菌株 ,小鼠实验研究其毒力 .结果 :PCR结果显示 galU基因完全被erm基因所替代 ,小鼠毒力实验表明缺陷菌株毒力显著下降 .结论 :galU缺失突变体在小鼠体内不能形成荚膜导致其难以在小鼠体内存活 ,可作为筛选肺炎链球菌体内诱导启动子的宿主菌 .用LFH PCR作基因突变 ,可完全替代靶基因 ,简便、快速 ,是肺炎链球菌功能基因组研究的一种有效的方法 .
- 孟江萍尹一兵袁军张雪梅蓝锴陈淑惠王虹涂植光
- 关键词：链球菌肺炎多糖类突变聚合酶链反应
