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沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建被引量：3: 2011年; 背景:Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。目的:构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。方法:利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。结果与结论:实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。; 阮静王旭李煜生刘爱华姜勇; 关键词：TOLL样受体4 RNA干扰慢病毒炎症

髓样相关蛋白8真核表达载体的构建及其细胞内定位: 2010年; 目的:构建小鼠髓样相关蛋白8(MRP8)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应扩增得到MRP8编码序列,并将其克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后将重组质粒瞬时转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察结果。结果:重组质粒经聚合酶链反应、酶切和测序鉴定证明构建正确,并且该质粒能够在NIH3T3细胞的胞浆、胞核中广泛表达,表达产物主要定位在细胞核中。结论:成功构建带有HA标签的MRP8真核表达载体。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究MRP8作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。; 伍丽琼吴翠玲王娟徐佳邓鹏姜勇; 关键词：血凝素类转染细胞内定位

人BNIP3基因在Hela细胞中的表达及定位被引量：1: 2009年; 目的:构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体,观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法:采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染Hela细胞。BNIP3经AlexaFluor 488免疫荧光标记,线粒体用MitoFluor Red 589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定构建正确,并在Hela细胞中能够表达,在荧光显微镜下观察,BNIP3-HA融合蛋白分布于线粒体。结论:成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。; 陈登宇刘芸钟田雨王蔚赵明哲刘靖华姜勇; 关键词：基因 BCL-2 HELA细胞线粒体荧光免疫测定细胞内定位

髓样相关蛋白14真核表达载体的构建及其细胞内定位研究: 2008年; 目的:构建小鼠髓样相关蛋白14(MRP14)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到MRP14编码序列。然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果:重组质粒经聚合酶链反应(PCR)、酶切和测序鉴定证明构建正确。转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论:成功构建带HA标签的MRP14真核表达载体。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为下一步深入研究MRP14作用细胞的信号通路提供了一个重要工具。; 刘铮徐佳伍丽琼王娟邓鹏姜勇; 关键词：血凝素细胞内定位

一种用于上调内源性人SOD1表达多肽筛选的随机文库及细胞系的构建: 2010年; 目的以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为示踪物,建立一种简便、经济、有效的随机多肽文库,为进一步筛选出可上调内源性人SOD1表达多肽的药物奠定基础。方法采用点突变技术,在pET-14b-His-Tat-EGFP载体多克隆位点XhoI之后插入12个随机多肽的36个随机碱基序列。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000包裹已构建的重组质粒pDsRed1-1-SOD1p后,转染NIH/3T3细胞,荧光显微镜观察SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的表达。用G418筛选稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的细胞系,荧光显微镜检测红色荧光蛋白的表达及定位。结果在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库理论上至少包含了107个独立克隆,且几乎所有克隆插入的随机片段都是36个碱基。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞质及细胞膜上均有携带SOD1启动子的红色荧光蛋白的表达。结论成功建立随机多肽表达文库,获得了稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的NIH3T3细胞系。; 宋方丽史晓兰黄劭刘亚伟姜勇; 关键词：肽库点突变转录启动子

白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位被引量：1: 2009年; 目的:构建白蛋白-血凝素(Alb-HA)融合蛋白的真核表达载体,观察Alb在NIH3T3细胞中表达和定位。方法:采用两步克隆法将HA和Alb的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染NIH3T3细胞在荧光显微镜下观察Alb的表达和分布。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在NIH3T3细胞中大量表达,免疫荧光标记后在荧光显微镜下观察,Alb-HA融合蛋白分布于细胞质内。结论:成功构建Alb-HA融合蛋白表达载体并表达于NIH3T3细胞中,为下一步深入研究Alb的细胞内功能奠定了基础。; 刘承武陈登宇胡水旺刘靖华姜勇; 关键词：白蛋白 NIH3T3细胞细胞内定位

基于TAP技术的TAT-PTD相互作用膜蛋白的筛选与鉴定: 目的:基于串联亲和纯化（tandem affinity purification,TAP）技术的原理,利用硫酸乙酰肝素的类似物—肝素进行干预,筛选与人类Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式转录激活因子（trans-act...; 邓鹏冯国开刘芸吴向玲姜勇; 文献传递

小鼠肝脏细胞质膜蛋白质组的提取和二维液相色谱分离: 2008年; 目的提取小鼠肝脏细胞质膜蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离细胞质膜蛋白质组的方法。方法采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心分离和富集分小鼠肝脏细胞质膜蛋白,样品经脱盐及用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.5～4.0之间的组分进行二维反相高效液相色谱分离,最后将获得的二维UV图通过ProteoVue软件转换成UV/pI图谱。结果成功提取了肝脏细胞质膜蛋白,并通过二维液相色谱成功建立了小鼠肝脏细胞质膜蛋白的二维UV/pI图谱,收集了一维色谱聚焦分离的pH8.5～4.0区间的16个组分,并将每个组分分进行二维色谱分离后转换为UV/pI图谱。结论为进一步全面研究小鼠肝脏细胞质膜蛋白功能和疾病差异蛋白质组研究打下了基础。; 李红梅陈丽夏高晓赵明哲胡水旺姜勇; 关键词：二维液相色谱蛋白质组肝脏

带有负电荷的Hela细胞穿透肽内化机制及生物学功能的初步研究: 目的:细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段,大多含有较多的碱性氨基酸。生理状态下,穿透肽分子的正电荷残基可与细胞表面蛋白聚糖多糖链的负电荷发生作用,介导了穿透肽与...; 刘芸刘爱华吴向玲江力玮罗海华邓鹏姜勇; 关键词：细胞穿透肽负电荷; 文献传递

Kindlin家族成员研究进展被引量：5: 2010年; Kindlin是一族新发现的黏着斑蛋白,包括Kindlin-1、Kindlin-2和Kindlin-3三个成员.不同Kindlin家族成员在进化上具有高度同源性和保守性,参与了多种重要细胞生理过程,例如细胞迁移、增殖和分化的调控.Kindlin通过与β整合素胞内段的相互作用,在细胞-细胞外基质黏附、细胞-细胞间连接、细胞骨架重构以及整合素介导的双向信号传递中都具有重要作用.Kindlin家族成员的异常与多种遗传性疾病、心血管疾病及肿瘤的发生和发展密切相关.Kindlin与整合素作用机制的深入研究,不但可以丰富对细胞黏附和迁移的理论认识,而且将有助于临床上相关疾病的治疗.; 熊盈龚小卫姜勇; 关键词：整合素细胞黏附信号转导

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国家自然科学基金(U0632004)

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