江西省自然科学基金(2009GQY0204)
- 作品数：6 被引量：6H指数：1
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- 相关机构：南昌大学第一附属医院江西省妇幼保健院重庆医科大学更多>>
- 发文基金：江西省自然科学基金江西省教育厅科学技术研究项目国家自然科学基金更多>>
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- 人LMP-1基因腺病毒重组体的构建及其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达
- 2012年
- 目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达。方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序。双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达。线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1。通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度。用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达。结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组。通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5×109pfu/ml。荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组。结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础。
- 刘会文黄路韩智敏罗嘉全杨东詹平戴闽曹凯
- 关键词：LIM矿化蛋白-1重组腺病毒载体表达载体构建骨肉瘤细胞
- 尤文肉瘤EWS-FLI1融合蛋白B淋巴细胞表位的预测及鉴定
- 2011年
- 目的:预测及鉴定尤文肉瘤EWS-FLI1融合蛋白的B淋巴细胞表位。方法:采用综合法预测EWS-FLI1蛋白的二级结构及B淋巴细胞表位,运用标准Fmoc方案合成预测的表位肽,HPLC和MS进行表位肽的纯度分析及分子量鉴定,ELISA法检测表位肽的抗原性,并测定表位肽特异性免疫血清效价,Western blot鉴定免疫血清与EWS-FLI1蛋白亲合力。结果:通过综合法预测得到3个高分值的B淋巴细胞表位,HPLC分析合成的表位肽纯度>85%,MS鉴定表位肽的分子量无误,ELISA法检测证实3个B淋巴细胞表位肽均可获得强的抗原抗体反应,其中表位肽P2的抗原性最强,在1∶40时A450=2.46,达到最高,1∶10 240稀释后抗原抗体反应仍呈阳性;用这3个B淋巴细胞表位肽免疫新西兰兔也能获得理想的抗体效价,其中表位肽P2获得的抗体效价最高,1∶512 000稀释时A450=1.11;Western blot鉴定表位肽P1、P2免疫血清能够结合EWS-FLI1蛋白。结论:尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白的B淋巴细胞表位肽P1、P2具有潜在的抗原性和免疫原性。
- 黄路罗嘉全刘会文张战民廖翔邓高荣曹凯安洪舒勇韩智敏
- 关键词：尤文肉瘤融合蛋白嵌合蛋白
- LIM矿化蛋白1促进成骨的研究现状被引量：4
- 2011年
- 目的 LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白,通过调节BMPs信号通路而促进成骨分化。近年来,研究表明LMP-1作为成骨信号途径的上游信号分子级联放大下游成骨信号,增加成骨细胞对BMPs的敏感性,招募众多的成骨因子共同参与成骨,最终促进细胞成骨分化和诱导骨形成。本文就LMP-1的结构特点、诱导成骨机制、LMP-1用于基因治疗的种子细胞及载体的选择等研究现状作一综述。
- 刘会文罗嘉全韩智敏曹凯
- 关键词：LIM矿化蛋白1种子细胞基因治疗
- RNA干扰细胞周期蛋白依赖激酶6基因对尤文肉瘤细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2013年
- 背景与目的:细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,有实验报道其在尤文肉瘤细胞中呈高表达,但在尤文肉瘤细胞中的生物学功能及相关机理仍不十分清楚。本研究旨在通过研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默CDK6基因表达,探讨其对尤文肉瘤A673、SK-ES-1细胞生物学行为的影响。方法:将化学合成的CDK6-siRNA转染至A673及SK-ES-1细胞中,实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK6 mRNA的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后细胞CDK6以及CDK6下游因子视网膜母细胞瘤基因(Rb)、磷酸化Rb(P-Rb)的蛋白表达;分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移以及侵袭能力的变化。结果:实时荧光定量PCR结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6的表达(P<0.01)。抑制CDK6表达后细胞的增殖速度明显减缓,细胞周期分布发生改变,G0/G1期细胞的比例上升,而S期细胞的比例下降,细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01)。各组细胞的迁移能力:untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(516.00±58.59)个、(534.00±124.77)个、(192.33±68.92)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(371.33±29.67)个、(363.33±60.28)个、(200.00±20.00)个,差异有统计学意义(P<0.01);各组细胞的侵袭能力:untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(251.00±42.93)个、(238.67±78.62)个、(94.67±23.03)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(310.00±35.36)个、(302.33±41.31)个、(105.00±54.08)个,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6以及下游因子P-Rb的表达(P<0.01),但细胞总Rb表达量无明显变化。结论:针对CDK6基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK6基因及蛋白的表达,并抑制尤文肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移,诱导其凋亡。
- 张中卒黄路虞志明陈翔韩智敏杨东詹平曹凯
- 关键词：尤文肉瘤RNA干扰
- Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立
- 2013年
- 目的:构建携带let-7a基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma,ES)细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。方法:通过Gateway克隆技术,扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段,与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与母载体——pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应,生成目的质粒——pLV.Des2d.P/neo-EF1A>eGFP/let-7a;通过PCR及测序验证目的质粒;将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株A673和SK-ES-1获得A673/let-7a、SKES-1/let-7a细胞株;通过real-time PCR检测稳定转染细胞株内let-7a的表达水平,Western blot检测其靶基因CDK6的表达。结果:PCR证实获得的目的条带与理论值相符,测序分析证实携带let-7a的真核表达载体插入序列及位点正确;real-time PCR及Western blot检测结果显示,与转染空载质粒及未处理组的A673、SK-ES-1细胞株相比,稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a,分别达到8.5倍(P=0.000)和6.5倍(P=0.001),差异具有统计学意义;且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少。结论:成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。
- 张中卒黄路虞志明张政韩智敏杨东詹平曹凯
- 关键词：尤文肉瘤慢病毒
- Let-7a对尤文氏肉瘤细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:探讨微小RNA(microRNA,miRNA)let-7a对尤文氏肉瘤A673和SK-ES-1细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法:将成熟的let-7a片段(has-miR-let-7a mimic)转染至A673和SK-ES-1细胞中,实验分为转染组(转染has-miR-let-7a mimic)、对照组(转染has-miR-let-7a mimic-control)和未转染组(仅加入脂质体)。Has-miR-let-7a mimic转染后,应用实时荧光定量-PCR法检测细胞中let-7a的表达,CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,FCM法检测细胞的周期分布和凋亡变化,Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测细胞中细胞周期依赖性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)、Rb和磷酸化-Rb(phospho-Rb,p-Rb)蛋白的表达。结果:与未转染组和对照组比较,转染has-miR-let-7a mimic后的A673和SK-ES-1细胞中let-7a的表达水平明显上调(P<0.01),细胞增殖受到抑制(P<0.01),G0/G1期细胞所占比例上升(P<0.01),细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显下降(P<0.01),细胞中CDK6和p-Rb蛋白的表达水平明显下降(P<0.01),而Rb蛋白的表达水平无明显变化。结论:Let-7a可抑制尤文氏肉瘤A673和SK-ES-1细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡,这一作用可能部分依赖于let-7a靶向抑制CDK6的表达。
- 张中卒黄路虞志明陈翔张政韩智敏杨东詹平曹凯
- 关键词：肉瘤EWING微RNAS细胞细胞
