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红豆杉细胞稳定生产紫杉醇中的同步化协同诱导作用被引量：2: 2009年; 同步化协同诱导可以稳定提高曼地亚红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量。细胞培养周期第8d的低温同步化处理可促使细胞达到最高同步化率(20.4%),而茉莉酸甲酯(MJ)的协同诱导可提高紫杉醇产量,使紫杉醇产量最高值达到54.7mg·L-1。在细胞生长周期第8d,未经低温同步化的红豆杉细胞中的关键酶基因DXR、HMGR、GGPPS和DBAT的表达量在MJ诱导24h后均迅速下降,但在低温同步化的细胞中紫杉醇表达量下降缓慢,60h后仍维持较高的水平。低温同步化和MJ协同诱导的红豆杉细胞中,紫杉醇合成关键酶基因高效稳定的表达可能是引起紫杉醇产量稳定提高的原因之一。; 李丽琴付春华赵春芳王圣余龙江; 关键词：同步化曼地亚红豆杉紫杉醇

ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响被引量：6: 2012年; ORCA3是一个受MeJA诱导的调控植物基础和次生代谢的转录调控因子。本文拟探讨ORCA3转录因子对红豆杉细胞中紫杉醇生物合成的影响,旨在为创制紫杉醇稳定高产的红豆杉细胞系,解决细胞大规模培养中紫杉醇含量低的瓶颈问题提供参考。从长春花中克隆ORCA3基因后,采用农杆菌介导法转入红豆杉细胞中,通过PCR、组织化学活性染色等检测法,筛选得到20余株转基因细胞系。HPLC检测转基因细胞系内紫杉醇含量表明:与阴性对照相比,转基因细胞系的紫杉醇含量增加了0.5～2.5倍,最高可达159.315μg/g。因此,ORCA3转录因子可以调控红豆杉细胞中紫杉醇合成。; 于小青杨海燕张蒙栗茂腾付春华余龙江; 关键词：红豆杉紫杉醇

DNA甲基转移酶RNAi干涉载体的构建及其鉴定: 2010年; DNA甲基化(DNA Methylation)是真核生物基因组最常见的DNA共价修饰形式,影响蛋白质-DNA的相互作用,在基因表达的调控上起着重要作用。RNAi(RNA interference)干涉是关闭特定基因功能的新技术,在植物功能基因组、植物发育及生理代谢途径调控等方面有着广泛应用。本文根据植物DNA甲基转移酶(DNMTs)的保守序列设计引物,首先从拟南芥总基因组DNA中克隆出DNA甲基转移酶基因保守片段,然后以此保守片段为模板扩增长度约570bp的靶序列用于构建RNAi载体。根据RNAi作用机制,将570bp靶序列正向、反向连接到pHANNIBAL载体上,然后将带有此反向重复结构的完整ORF框连接到植物表达载体pGreeII上,经过酶切鉴定和测序分析证实DNA甲基转移酶RNAi重组表达载体构建成功。转化红豆杉细胞表明该干涉载体具有生物学功能,为研究受DNA甲基化调控的性状改良打下基础。; 王志伟于小青郭兴东邝美华余龙江栗茂腾付春华; 关键词：RNAI

红豆杉脱分化过程中的遗传和表观遗传变异被引量：11: 2009年; 采用扩增片段长度多态性(AFLP)和甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析红豆杉脱分化前后基因组DNA和DNA甲基化状态的变化。选用32个AFLP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出1834个片段,无多态性片段产生。这说明红豆杉植株在诱导形成愈伤组织的过程中基因组DNA保持高度的遗传稳定性。另用32个MSAP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出1197个片段,总扩增位点的甲基化水平由脱分化前的12.4%上升为16.2%,表明红豆杉在脱分化过程中的某些位点发生了甲基化。红豆杉脱分化前后的DNA甲基化模式也存在较大差异,说明DNA甲基化对愈伤组织形成有调控作用。; 李丽琴付春华赵春芳吴文娟余龙江; 关键词：脱分化红豆杉 AFLP MSAP

Isolation and Identification of a Taxol-producing Endophytic Fungus Identified from Taxus media被引量：8: 2010年; [Objective] The aim was to isolate and identify a taxol-producing endophytic fungus from Taxus media. [Method] 32 strains of endophytic fungi were identified form the inner bark of T. media,and their fermentation products were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). [Result] Through the screening,a strain of taxol-producing endophytic fungi M57 was obtained,which could produce 45-50 μg/L of taxol,and M57 was defined as Rhizopus sp. through morphological observation and 18S rDNA sequence analysis. [Conclusion] The finding of Rhizopus sp. M57 provided a promising strain for producing taxol with taxol-producing fungi fermentation process.; 李佟清张志建张鹏张鹏王春兰刘博付春华付春华

农杆菌介导的曼地亚红豆杉细胞遗传转化体系的建立被引量：3: 2012年; 建立了根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化体系,为红豆杉细胞的遗传改良打下基础。最优转化条件是:菌液光密度A600=0.6,侵染时间25 min,共培养最适温度21℃,共培养时间48 h;最适头孢霉素(Cephamycin,Cef)抑菌浓度为300 mg/L;最优的除菌及筛选方式为:用含100 mg/L头孢霉素的无菌水冲洗共培养后的细胞10 s,然后将细胞转至含300 mg/L头孢霉素的抑菌培养基上,两周后转至含150 mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)或8 mg/L潮霉素(Hygromycin,Hyg)的筛选培养基上筛选。采用小愈伤团法筛选转基因纯系,GUS染色显示,筛选后转化细胞株的阳性细胞占80%以上。; 许想平于小青董艳山付春华余龙江; 关键词：红豆杉细胞

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国家自然科学基金(20776058)