国家自然科学基金(30671762)
- 作品数：14 被引量：56H指数：5
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- 相关机构：吉林大学吉林出入境检验检疫局吉林工商学院更多>>
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- 抗氯霉素单克隆抗体的制备、纯化及其特异性鉴定被引量：10
- 2008年
- 目的:获得能稳定分泌高亲和力抗体的抗氯霉素杂交瘤细胞。方法:重氮化法偶联制备氯霉素(CAP)的免疫抗原和检测抗原(CAP-BSA和CAP-OVA)。应用常规技术融合,三次有限稀释克隆和间接竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞株,并鉴定抗体特异性。结果:得到一株能够稳定分泌高亲和力,特异性强抗体的杂交瘤细胞株4B12,辛酸-硫酸铵法纯化体内诱生法制备的腹水;纯化后的抗体效价>1:256000,杂交瘤细胞染色体平均数为50±2,分泌的抗体属于IgG1亚类,相对分子质量为157.92ku,亲和常数为8.26×108M-1;与甲砜霉素、庆大霉素、泰乐菌素、青霉素、链霉素和卡那霉素无交叉反应。结论:该细胞株可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求。
- 王颖任立松李研东沈庆丰柳增善
- 关键词：氯霉素抗体单克隆纯化
- 抗磺胺二甲嘧啶单链抗体基因的克隆与序列分析
- 2008年
- 采用RT-PCR方法成功克隆出抗磺胺二甲嘧啶(SM2)单抗的杂交瘤细胞中396 bp的VH和339 bp的VL可变区基因,再通过重叠延伸PCR方法,由引入的(Gly4Ser)3柔性肽体外组装抗717bp的SM2-ScFv基因。测序经NCBI Blast比较分析和Expasy预测分析。结果表明:所得ScFv具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征,单链抗体的结构符合抗体可变区的功能区的框架区和可变区的结构特点,是抗磺胺二甲嘧啶的可变区基因,且经lingker连接后为影响轻重链的结构。
- 安宇王颖张东杰柳增善
- 关键词：磺胺二甲嘧啶单链抗体
- 海产品贝毒素大田软海绵酸ELISA及HPLC-MS/MS检测方法的研究被引量：6
- 2009年
- 为了检测海产品贝毒大田软海绵酸,保障其食用安全,利用活泼酯法将小分子OA与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术建立分泌抗OA的杂交瘤细胞株,并对其各种特性进行分析;小鼠腹水法大量生产抗体,纯化后建立ELISA方法,同时建立OA的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)检测法,并对部分市售海产品进行了实际检测,ELISA方法标准曲线为y=-34.212x+83.49,相关系数为0.9784,线性范围0.4～25μg/L,灵敏度0.18μg/L;HPLC-MS/MS检测方法标准曲线y=193.07x-780.6(Q1/Q3:m/z827.4～m/z723.5)和y=83.021x-335.6(Q1/Q3:m/z827.4～m/z809.5),R2均为0.9991,线性范围10～800μg/L,灵敏度小于2μg/L,平均RSD为4.34%。在检测的实际样品中两种样品ELISA呈阳性反应,其中一种经过了HPLC-MS/MS的验证。所建立的ELISA及HPLC-MS检测方法均可用于海产品腹泻性贝毒OA限量标准检测,为进出口海产品OA标准方法的建立提供实验基础。
- 卢士英柳增善周玉李岩松张代辉于光于师宇任洪林
- 关键词：ELISAHPLC-MS/MS海产品
- 氯霉素单克隆抗体ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2007年
- 目的建立CAP间接和直接ELISA检测方法。方法用重氮化法分别偶联氯霉素(Chloramphenicol,CAP)与BSA和OVA作为免疫原和检测原,腹腔注射8周健康雌BALB/c小鼠大量制备抗CAP的单克隆抗体并优化条件,建立了CAP的快速、灵敏、简便的直接和间接竞争ELISA方法。结果两种检测方法的回归方程和相关系数分别为:y=-25.411x+97.041,R2=0.9889和y=-27.768x+103.91,R2=0.9889,线性范围分别为1.87-75 ng/mL和0.93-25ng/mL,对CAP的最低检出浓度为0.97 ng/mL和0.35 ng/mL。并利用所建立的两种ELISA方法对鸡肉模拟样品进行了检测,其检测样品的回收率分别为98.607%,85.152%。结论为下步CAP的试纸条或试剂盒建立提供基础。
- 王颖张磊饶星李月婷柳增善
- 关键词：氯霉素CIELISA
- 大田软海绵酸液相色谱串联质谱检测方法的研究被引量：8
- 2007年
- 目的：利用高效液相色谱一串联质谱法建立海产品中大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）的检测方法。方法：贝样品提取液经AccuBond^Ⅱ SPE silica固相萃取小柱预分离和富集，用三级四极杆串联质谱（MS／MS）作为HPLC的检测器，使用正离子电喷雾（ESI）电离方式，多反应监测（MRM）扫描模式，选择母一子离子对m／z 827→m／z723，m／z827→m／z809作为定量检测的离子对，HPLC的流动相为乙腈：1％甲酸-水（体积比70：30），色谱柱为Agilent Extend—C18（2．1×150mm，φ5．0μm），对OA标准品及加标样品和实际样品进行HPLC—MS／MS检测。结果：方法线性回归方程为Y=193．07X-780．6（Q1／Q3：m／z827．4→723．5）；Y=83．021X-335．6（Q1／Q3：m／z827．4→809．5），相关系数一均为0．9991；线性范围为10～800μg／L。样品平均回收率为83．99％，平均RSD为4．34％。结论：建立的HPLC—MS／MS方法灵敏、快速、准确．可用于海产品中贝类样品OA限量标准检测。
- 卢士英张代辉周玉任洪林孟宪梅柳增善于光
- 关键词：高效液相色谱-串联质谱法固相萃取
- 副溶血性弧菌融合鞭毛基因的表达与免疫学性质被引量：3
- 2008年
- 采用柔性Linker序列(Gly4Ser)对目的基因进行串联(FlaA-FlaF-FlaB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在E.coliBL21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫獭兔制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F3并在E.coliBL21中得到表达,表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量23.5%),基因序列全长3420bp,编码1140个氨基酸,蛋白相对分子质量为119000,测序结果与设计序列一致性为99%。ELISA和琼脂扩散试验表明,融合鞭毛F3与其他几种中毒性弧菌鞭毛具有一定的免疫交叉性,与多种非目标菌不发生反应。从而表明,多联融合鞭毛基因的表达质粒已构建成功并制备了抗血清,为利用融合鞭毛的方法检测食物中毒性弧菌,进而建立食物中毒性弧菌广谱、快速的检测方法奠定了基础。
- 李涛柳增善魏艳华王颖杜承卢士英张国才
- 关键词：副溶血性弧菌免疫特性
- 食物中毒性弧菌三联融合毒素基因克隆与表达
- 本研究采用柔性Linker（GGGGS）和重叠延伸PCR方法将三个毒素基因,即副溶血弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvhA和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmhA的成熟蛋白基因片段进行串联,得...
- 李月婷卢士英周玉饶星霍方珍任洪林柳增善
- 关键词：食物中毒弧菌串联基因蛋白表达
- 文献传递
- 抗氯霉素单链抗体基因的表达及免疫学活性初探被引量：3
- 2008年
- 目的:构建和原核表达抗氯霉素(CAP)的单链抗体基因,并进行免疫学活性的初步测定。方法:通过柔性连接肽(G4S)3,将成功克隆出的氯霉素单抗4B12的重、轻链可变区基因(VH和VL)组装成CAP-SCFV,并在5′和3′引入相应的酶切位点,克隆到pET-22b(+)后转化入E.coliBL21的工程菌;分别在25℃和37℃诱导表达,SDS-PAGE电泳和间接ELISA分析表达的目的蛋白和纯化后的免疫活性。结果:经酶切鉴定,DNA测序分析和NCBI比较,证明基因构建正确,轻链为鼠源κ链,所得单链抗体具有功能性鼠抗体可变区基因的特征;SDS-PAGE和间接ELISA分析检测表达产物,目的蛋白为24ku,纯化后的蛋白在64000倍稀释时免疫学活性良好。结论:在成功的原核表达了CAP-SCFV的同时保证了CAP单链抗体的抗原表位暴露正常,为药物残留的下步检测方法建立奠定了基础。
- 王颖李涛周玉杜承柳增善
- 关键词：氯霉素单链抗体分泌表达药物残留
- 抗大田软海绵酸单链抗体基因的克隆、序列分析与表达
- 2009年
- 为利用大田软海绵酸单链抗体建立检测方法,提取分泌抗大田软海绵酸单克隆抗体的3C5杂交瘤细胞株总RNA,用鼠源单链抗体可变区引物RT-PCR法扩增单克隆抗体可变区基因VH和VL,用一段柔性肽链-(Gly4Ser)3将其连接成单链抗体基因ScFv。克隆后测序,NCBI Igblast及ProtParam进行分析;结果获得一开放读框为726 bp的ScFv基因的克隆子,包括366 bp的VH、45 bp的Linker和315 bp的VL,序列中有明确的框架区(FR)和互补决定区(CDR);共编码242个氨基酸,在重链的第24、98位和轻链的23、87位氨基酸为抗体可变区特征性的半胱氨酸残基;经检索分析,所获序列与多种鼠源单链抗体基因同源性很高,具有重组功能性鼠抗体可变区基因的特征,申请GenBank登录号为EU574932,经原核表达其产物经ELISA检测具有与OA结合的活性。OA单链抗体基因的获得为开发OA等海生物毒素检测方法提供了新的思路,并为利用融合单链抗体同时快速筛检多种海洋生物毒素的检测方法提供重要的实验材料。
- 卢士英孟宪梅周玉宫彬彬任洪林柳增善
- 关键词：单链抗体基因克隆原核表达
- 大田软海绵酸单克隆抗体ELISA检测方法的建立被引量：16
- 2007年
- 利用BALB／c小鼠腹水大量制备抗大田软海绵酸（okadaic acid，OA）的单克隆抗体，并以此抗体为探针建立了0A的快速、灵敏、简便的ELISA检测方法——直接和间接竞争抑制性ELISA方法，2种检测方法的回归方程和相关系数分别为：y=-38．678χ＋130．01，R^2=0．9886和y=-34．212x＋83．49，R^2=0．9784，线性范围为1.56～75μg／L和0.4425μg／L，对OA的最低检出质量浓度为0．6μg／L和0．18μg／L。并利用所建立的2种ELISA方法对贝类模拟样品及实际样品进行了检测，样品回收率分别为84．72％和98．38％。结果表明，此方法可满足海产品中贝类样品0A限量标准检测。
- 卢士英周玉李岩松任洪林霍方珍王颖柳增善于光
- 关键词：单克隆抗体ELISA
