国家自然科学基金(30971166)
- 作品数：10 被引量：8H指数：2
- 相关作者：李冰付欣洪玮周问渠陈云芳更多>>
- 相关机构：广州医学院广州医科大学北京大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 香烟烟雾法肺动脉高压小鼠模型肺组织HIF-1α和Nrf2表达被引量：2
- 2017年
- 以香烟烟雾熏烟法建立肺动脉高压(PAH)小鼠模型,将C57B6J小鼠随机分为对照组和模型组,每组10只,对照组小鼠不作任何处理,模型组采用香烟处理:每天2次,每次2 h,10支/h,6 d/周,连续6个月的建模方法;使用小鼠右心室压力测定仪(BIOPAC Systems,MP150)测定小鼠右心室压力(RVSP);将肺小动脉进行胶原纤维染色(Van-Gieson法),结合Image Pro Plus软件分析,测量肺小动脉血管的中层壁厚和肺小动脉血管的外径,计算肺小动脉厚度的变化;利用Western Blot法检测Nrf2和HIF-1α蛋白在肺组织的表达.结果表明:1)与对照组相比,模型组小鼠右心室压力明显增加,肺小动脉血管壁明显增厚,管腔变狭窄,右心室与体重的比值显著增加;2)与对照组相比,模型组小鼠肺组织HIF-1α蛋白表达明显增加,而Nrf2蛋白表达明显减少.研究结果意味着:HIF-1α与Nrf2在香烟烟雾法建立的肺动脉高压小鼠肺组织中表达异常.
- 陈云芳王胜钱自亮
- 关键词：肺动脉高压低氧诱导因子1Α
- MTT法用于药物对L2细胞毒性的实验研究被引量：3
- 2012年
- 目的:评价噻唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的毒性作用的可靠性。方法:大鼠肺泡上皮L2细胞以叔丁基对苯二酚(TBHQ)10-100μM,BSO以1-10mM分别处理,用MTT法检测细胞活性、JC-1(5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)荧光染料法检测细胞线粒体电位改变、台盼蓝排斥实验检测细胞死亡率,分析各指标的情况。结果:在处理剂量范围,MTT法检测到的光密度(OD)值未能达到一般判断的半数抑制浓度(IC 50)水平,最高抑制率仅达到30%左右;台盼蓝排斥试验检测数据表明TBHQ的LC 50值为50μM,丁硫氨酸亚砜胺(BSO)为5 mM;利用JC-1荧光染料判断的半数凋亡剂量分别为50μM和7 mM。结论:MTT法作为最常采用的细胞生长抑制检测手段,但在某些特定实验中可能不能客观地反映细胞的活性,建议多种方法结合进行评价。
- 陈云芳王胜李冰
- 关键词：细胞毒性叔丁基对苯二酚
- 转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达被引量：1
- 2013年
- 为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853～-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2),比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2(differentiated embryochondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2)真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和超级迁移率实验(supershift assay)检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响.结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(-3 853～-3 848)与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox(-3 853～-3 848)有关.
- 黄楚琴周问渠付欣洪玮蔡磊李冰
- 不同细胞中STAT元件对刺激因子的特异性应答被引量：1
- 2012年
- 以高通量药物筛选为目的,构建转录因子STAT元件驱动的萤火虫荧光素酶报告载体,并进行功能初步验证.人工合成含IRF-1和C-FOS基因上游调控序列中的2个STAT元件的DNA片段,克隆于pGL3-promoter报道质粒作为报道载体pSTAT-luc;为检测其对不同有效因子刺激的反应性,该报道载体与荧光内参照载体pRL-SV40瞬时共转染不同细胞,在各种因子刺激条件下,双荧光素酶检测系统测定化学发光强度.结果显示,pSTAT-luc的报道基因载体符合预期设计;该载体转染细胞实验显示,在STAT途径阳性的HeLa、A549和MCF-7细胞中,特异刺激因子INF-γ和抑瘤素OSM处理能够剂量依赖性的引起细胞内萤火虫荧光素酶的升高;在STAT途径阴性的PC-12细胞,上述因子不能引起荧光素酶的活性改变;以非该途径因子刺激时,HeLa、A549和MCF-7细胞未见发光水平的改变.结果表明,构建的报道系统具有阳性细胞反应特异性以及阳性刺激-反应特异性,能够用于建立靶向STAT信号通路的高通量药物筛选平台.
- 黄晓敏李冰
- 关键词：Γ-干扰素
- 大鼠GCLC基因5’-上游调控区域(-876～+1)的3个E-box元件功能分析
- 2014年
- 目的:GCLC基因表达调控有助于在分子水平了解GSH变化的机制,对进一步探索机体抗氧化失衡的机制有重要意义。本实验主要研究GCLC基因上游调控区域(-876^+1)三个相邻E-box元件的作用及探讨E-box元件组合的基因转录作用机制。方法:利用PCR定点缺失法构建多种组合的缺失E-box元件的GCLC上游启动子序列的报告基因载体。将所构建的载体在脂质体介导下瞬时转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2细胞),通过比较转染后细胞的荧光素酶活性,分析E-box元件对GCLC基因转录活性的影响。结果:成功构建出多组定点缺失E-box元件的GCLC-Luc基因。在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中转染缺失了E-box的GCLC-Luc组较转染GCLC-Luc组均有明显升高(P均<0.05)。结论:三个E-box元件(-804^-779,-729^-724,-590^-585)在GCLC基因的基础状态下的转录表达中都起到一定的抑制作用,可能以转录因子及元件复合物形式抑制GCLC基因的转录调控。此结果揭示GCLC基因上其他E-box元件之间也可能存在着相互作用方式,而非简单的单独作用。
- 蔡磊黄楚琴李冰
- 活细胞荧光探针法实时检测细胞内活性氧与细胞凋亡
- 2015年
- 目的：建立能利用活细胞工作站和荧光探针动态监测细胞内活性氧（ROS）与细胞凋亡的新方法。方法将人支气管上皮细胞16HBE和肺癌A549细胞分别以工作浓度为5μmol/L的ROS活细胞荧光探针C10422和C10444、10 mg/L的线粒体功能探针JC-1孵育30 min、凋亡指示探针AnnexinV/PI孵育15 min后，用活细胞工作站连续记录1 mmol/L H2O2刺激时的特定波长荧光灰度值，评价细胞ROS，线粒体膜电位以及细胞凋亡指数。结果16HBE细胞在1mmol/L H2O2持续刺激下，ROS荧光探针C10422和C10444表现为特定波长灰度值持续增加，分别在80 min后和10 min后ROS水平明显升高（均P〈0.05）；线粒体膜电位荧光探针JC-1表现为两种波长荧光灰度值的转化，在H2O2持续刺激下，代表细胞线粒体功能的指标R/G比例在20 min以后明显下降（P〈0.05）；凋亡探针AnnexinV主要表现在细胞膜区域荧光聚集增强，但整体视野的荧光灰度变化不明显。A549细胞在相同的实验条件下1 mmol/L H2O2刺激时，ROS水平也升高但低于16HBE（P〈0.05）；而JC-1所探测的R/G比值曲线出现一个持续的下降峰后又部分回升。结论以活细胞工作站为基础结合活细胞荧光探针建立的检测方法能更客观地反映细胞的氧化应激行为和细胞凋亡状态。
- 李熹翀彭燕邓小亮付欣周问渠洪玮邹东霆李冰
- 关键词：活性氧细胞凋亡
- β-萘黄酮能抑制荧光素酶活性
- 2011年
- 目的:研究β-萘黄酮对荧光素酶活性的影响。方法:利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase报道载体(PL45)转染人肺腺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人子宫颈癌细胞HeLa,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞Bel-7402,人支气管上皮细胞16HBE,β-萘黄酮刺激后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响。wester blot检测β-NF刺激16HBE细胞后GCLC蛋白水平的变化。β-萘黄酮刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC/CMV2-luc+的A549和HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因表达的影响。PL45转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因的影响。结果:在各种细胞中,转染PL45报道载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。wester blot结果显示β-NF处理组GCLC蛋白的表达较DMSO对照组明显升高。在A549和HepG2细胞中,转染pRC/CMV2-luc+载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。PL45转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。
- 王胜陈云芳付欣洪伟李冰
- 关键词：基因转录调控荧光素酶报告基因
- 稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立
- 2014年
- 目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P<0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P<0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。
- 黄楚琴周问渠蔡磊洪玮付欣李冰
- 关键词：启动子荧光素酶报告基因
- 探讨细胞不同初始接种密度对转染效率的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:探讨不同初始接种密度对细胞转染效率的影响。方法:利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导GCLC基因(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位)及绿色荧光蛋白(GFP)表达载体转染大鼠肺泡上皮L2细胞,通过双萤光素酶报告基因系统检测萤光素酶活性值、荧光显微镜和流式细胞仪检测其GFP表达情况,来探讨细胞不同初始接种密度对转染效率的影响。结果:细胞初始接种密度不同,其转染效率也不同。结论:细胞不同初始接种密度对转染效率有显著性影响,转染细胞数适宜才能得到较高的转染效率。
- 洪玮付欣周问渠邹东霆李冰
- 关键词：脂质体转染效率绿色荧光蛋白
- β萘黄酮对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因表达的影响
- 2010年
- 目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮（β-NF）对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC）基因转录的影响，研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer—Luciferase报道载体（GCLC—Luc）转染大鼠支气管上皮细胞（RTE）和肝癌细胞（H4ⅡE），分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组，比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子，并比较筛选到的刺激因子β—NF对GCLC—Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β—NF实验组（10μmol／L）和DMSO空白对照组，以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ—GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC—Luc和激活蛋白1（AP-1）、NF—κB定点突变报道载体转染2种细胞，分β-NF实验组（10μmol／L）与DMSO空白对照组，比较各组荧光素酶值的变化，分析B—NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果1、10、100μmol／L的β—NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达，荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组（161354-1456、27524-218、15794-294比259714-1662，均P〈0．01）。在H4ⅡE中，1、10、100μmol／L的B—NF则促进其表达，荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组（5686±441、13601±746、13978±164比3645±367，均P〈0．01）。荧光定量PCR显示10μmol／L的β-NF作用下，RTE内源性γ—GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0．73倍，在H4ⅡE细胞中则是1．98倍。GCLC—Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后，RTE中各载体β—NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组（P〈0．01），而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组（P〈0．05）。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390～＋2bp范嗣内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细�
- 崔力军洪玮付欣冉丕鑫李冰
- 关键词：谷胱甘肽细胞特异性
