广东省科技计划工业攻关项目(2003C30303)
- 作品数：5 被引量：41H指数：3
- 相关作者：李刚李湘平刘雄李晓华彭英更多>>
- 相关机构：南方医科大学南方医院香港大学解放军第九四医院更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组腺相关病毒介导的特异性发夹状RNA敲低EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞转移的影响被引量：3
- 2009年
- 目的探讨EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP-1）对鼻咽癌细胞在体内增殖和转移能力的影响及其可能的机制。方法构建重组腺相关病毒（rAAV）一增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和rAAV-shRNA—LMP-1载体。以不同滴度的rAAV—EGFP转染鼻咽癌C666—1细胞，确定最佳转染复数（MOI）。rAAV—shRNA-LMP-1按MOI转染C666—1细胞，采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）鉴定抑制效率。将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下建立鼻咽癌移植瘤模型，观察裸鼠的肝脏成瘤及肝脏、肺脏转移情况。采用免疫组化法检测基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达，分析LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞成瘤和转移能力的影响及机制。结果rAAV—EGFP以5×10。病毒基因组数／细胞转染C666—1细胞，转染效率〉95％。rAAV—shRNA-LMP-1以5×10^4病毒基因组数／细胞转染C666—1后，LMP-1的表达抑制率〉90％。rAAV—shRNA—LMP-1转染组裸鼠的肝脏成瘤体积为（0．2527±0．1152）cm^3，与rAAV—EGFP转染组[（0．2533±0．0754）cm^3]的差异无统计学意义（P〉0．05），但rAAV—shRNA-LMP-1转染组裸鼠的肝转移率（50．0％）和肺转移率（33．3％）明显低于rAAV-EGFP转染组（均P〈0．05）。rAAV—shRNA—LMP-1转染组裸鼠的生存时间为（15．50±2．47）d，明显长于rAAV—EGFP转染组[（11．50±1．22）d，P〈0．05]。免疫组化染色结果显示，LMP-1抑制后，MMP-9的表达明显下调。结论通过rAAV介导RNA干扰序列能有效抑制LMP-1的表达，其可能通过下调MMP-9的表达抑制鼻咽癌细胞的转移，但对鼻咽癌细胞的生长无显著影响。
- 刘雄李刚张宝王路李晓华李湘平
- 关键词：鼻咽肿瘤重组腺相关病毒潜伏膜蛋白1
- DNA载体介导RNA干扰抑制LMP-1基因对鼻咽癌细胞转移能力的影响被引量：17
- 2006年
- 目的探讨应用DNA载体介导RNA干扰技术,抑制鼻咽癌细胞中EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP-1)表达的可能性,观察LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞转移能力的影响。方法将能转录出干扰RNA的DNA模板插入pAVU6+27质粒,构建能够介导RNA干扰的发夹状干扰RNA (shRNA)表达载体。采用磷酸钙共沉淀法,将质粒导入EB病毒(+)的鼻咽癌细胞C611,筛选LMP-1基因沉默的克隆,通过观察其贴壁生长能力、基底膜穿透能力和移动能力的变化,分析LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞转移能力的影响。结果在shRNA表达载体有效转染的C611细胞中,LMP-1基因的表达受到稳定抑制。肿瘤细胞转移实验表明,LMP-1基因沉默的C611细胞,贴壁生长能力提高,基底膜穿透能力和细胞移动能力均明显下降。结论shRNA表达载体能够在鼻咽癌细胞内介导RNA干扰,并获得对LMP-1基因稳定的抑制。LMP-1基因可能通过贴壁生长能力、基底膜穿透能力和细胞移动能力等,影响鼻咽癌细胞的转移。
- 李刚李湘平刘雄彭英林李家宓
- 关键词：RNA干扰LMP-1基因鼻咽癌肿瘤细胞转移
- 重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验被引量：4
- 2009年
- 目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。
- 刘雄李刚张宝王路李晓华李湘平
- 关键词：鼻咽癌重组腺相关病毒RNA干扰EB病毒潜伏膜蛋白1
- 腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1基因表达被引量：3
- 2006年
- 目的构建针对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1，LMP-1）的特异性发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）干扰序列的重组腺相关病毒（recombinant adeno—associated virus，rAAV）载体（rAAV-shRNA—LMP-1），介导其体外表达并鉴定其生物活性。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性shRNA干扰序列，采用分子克隆的方法，将干扰序列及U6启动子插入pAAV-2质粒中，采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-shRNA-LMP-1，测定其滴度及感染效率，RT-PCR鉴定目的基因的抑制效率。结果以rAAV-EGFP5×10^4v．g（virus genome，病毒基因组数）／细胞转染C666-1细胞，转染效率大干95％，PT—PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×10^4v．g／细胞转染C666—1后目的基因抑制效率大于90％。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达，为进-步研究肿瘤基因治疗，尤其是动物实验奠定了基础。
- 刘雄李湘平彭英李刚张宝李晓华周立辉
- 关键词：RNA干扰鼻咽肿瘤
- 小干扰RNA抑制EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞生长的影响被引量：19
- 2005年
- 目的探讨人工诱导RNA干扰技术在EB病毒潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP-1)功能研究中的应用价值,观察LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞生长的影响。方法人工合成4条双链不同序列的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),通过脂质体转染导入表达EB病毒基因的鼻咽癌C611细胞后,用半定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RTPCR)检测LMP1mRNA水平,筛选出能有效抑制LMP-1表达的siRNA序列。采用噻唑蓝法和流式细胞仪观察LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的变化。结果导入有效siRNA后,C611细胞中LMP-1mRNA水平下降90%以上,重复转染可使有效干扰时间延长至96h。LMP-1基因抑制后,EB病毒阳性的C611细胞增殖速度最多可下降至32.9%;细胞周期在G0G1期受阻。在同样处理下,EB病毒阴性的HNE2细胞的生长则未受到影响。结论全新的人工诱导RNA干扰技术能够有效抑制LMP1基因的表达,降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。
- 李刚李湘平彭英刘雄李晓华
- 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白1小干扰RNA半定量逆转录聚合酶链反应LMP-1基因EB病毒基因鼻咽癌细胞
