广东省医学科学技术研究基金(B2005078)
- 作品数：2 被引量：6H指数：2
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- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金广东省医学科学技术研究基金更多>>
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- 弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统的构建被引量：3
- 2008年
- 目的构建弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统,为弓形虫基因功能研究提供工具。方法通过PCR和酶切连接,首先构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)基因启动子驱动的绿色荧光蛋白基因载体pBSK-SAG1/5UTR-eGFP-SAG1/3UTR(pBSK-SAG1/GFP),然后构建以弓形虫热休克蛋白HSP70基因启动子驱动的反向重复序列RNAi载体pBSK-HSP70/5UTR-IntronC-HSP70/3UTR,将载体pBSK-SAG1/GFP中的SAG1/5UTR-eGFP-SAG1/3UTR片段克隆到载体pBSK-HSP70/5UTR-IntronC-HSP70/3UTR中形成载体pBSK-GFP-Hairpin,再将该载体中的GFP-Hairpin片段克隆到载体pHANA-0.5中形成弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统pHANA-hairpin。通过PCR分别扩增SAG1和缓殖子蛋白1(BAG1)基因的正向和反向序列,通过酶切连接,将正向和反向序列克隆到载体pHANA-hairpin中,分别构建靶向SAG1和BAG1基因的RNAi载体pHANA-hairpin/SAG1和pHANA-hairpin/BAG1。结果酶切鉴定和测序结果表明成功构建载体pHANA-hairpin、pHANA-hairpin/SAG1和pHANA-hairpin/BAG1。结论弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统成功构建,为下一步基因功能研究奠定基础。
- 吴焜程璐王琼郝丽陈晓光
- 关键词：弓形虫RNA干扰反向遗传学速殖子
- 弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系的建立被引量：3
- 2008年
- 目的建立弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,接种于NIH3T3细胞单层,进行体外培养。接种4h后,换用pH8.1的碱性培养基进行速殖子向缓殖子的诱导转化培养,RT-PCR检测缓殖子蛋白1(BAG1)基因的表达。将诱导的缓殖子重新用pH7.2的培养基在常规环境下培养,诱导缓殖子向速殖子转化。为探索温度对速殖子向缓殖子转化的影响,将接种RH株速殖子的NIH3T3细胞分别放在37℃、39℃、41℃、43℃中诱导转化培养,RT-RCR检测BAG1基因的表达。结果弓形虫RH株能在NIH3T3细胞单层中生长增殖,更换高pH值碱性培养环境后,能诱导弓形虫速殖子转化为缓殖子,RT-PCR检测出缓殖子期特异蛋白BAG1基因的表达,并且随着诱导时间的延长,BAG1基因mRNA的转录水平逐渐提高,表明有更多的速殖子转化为缓殖子。恢复pH7.2的常规培养条件,碱性诱导的缓殖子能转化为速殖子。在41℃诱导条件下,能诱导RH株速殖子转化为缓殖子。结论成功构建弓形虫体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系,为转化机制的研究奠定基础。
- 吴焜王琼郝丽程璐陈晓光
- 关键词：弓形虫体外培养速殖子
