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遗传印记基因PEG10转基因小鼠的建立及其皮下移植瘤生长和转移的变化被引量：1: 2009年; 目的建立PEG10转基因小鼠模型，研究PEG10对小鼠皮下移植瘤的生长和转移的影响。方法PCR阳性转基因鼠经RT—PCR、Westernblot鉴定后，皮下注射H22细胞，连续测量肿瘤体积。12d后取肿瘤和肝脏组织进行HE染色，肝脏组织进行SP染色，检测PEG10蛋白的表达。计量资料采用独立样本的f检验。结果阳性首建鼠的肝脏中检测到目的基因和蛋白的表达。转基因小鼠皮下瘤的体积（4．08、4．23cm3）及质量（6．89、6．48g）均显著高于野生型小鼠（1．61cm。及1．63g，P〈0．05），均向周围组织侵袭并出现肝转移，肝脏中检测到PEG10蛋白；野生型小鼠的肿瘤组织有包膜，未出现肝转移。结论构建的PEG10转基因小鼠模型可促进皮下移植瘤的生长、侵袭和转移。; 刘瑶林菊生郑新民谭锦泉汪志军张强吴伟常莹; 关键词：肝肿瘤转基因小鼠皮下移植瘤模型

靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响被引量：2: 2009年; 目的设计以髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建携带此shRNA的重组质粒,探讨脂质体转染该重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psi RNA-hH1neo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,通过RT-PCR及Western blot方法检测转染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达情况,筛选能高效抑制Mcl-1基因表达的shRNA重组质粒并应用MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和凋亡变化的情况。结果成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3。经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1重组质粒下调效应最强。MTT检测显示pMclsi-1可明显抑制HepG2细胞增殖,流式细胞仪测定转染后24 h细胞凋亡率为6.5%,48 h细胞凋亡率为15.6%,显著高于对照组(3.9%,P<0.05)。结论采用RNAi技术可特异阻断Mcl-1基因的表达,Mcl-1基因有促进细胞增生及抑制凋亡的作用。; 余琴陈琼黄焕军宋宇虎常莹田德安林菊生; 关键词：短发夹状RNA 细胞增殖

遗传印记基因PEG10沉默对人肝癌细胞Wnt/β-catenin信号转导通路的影响被引量：3: 2010年; 目的观察靶向封闭遗传印记基因PEG10对人肝癌细胞(HepG2)Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,探讨PEG10促进肝癌形成的可能机制。方法设计针对PEG10基因的shRNA,体外转录制备shRNA后利用脂质体转染技术转染肝癌细胞株HepG2,RT-PCR检测PEG10、β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平,应用免疫组化技术检测其蛋白表达水平。结果转染PEG10-shRNA后HepG2细胞PEG10 mRNA水平下降65.6%,其蛋白表达水平减少60.9%;同时,β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平随之分别下降52.5%、96.1%,蛋白表达水平分别减少94.3%、63.2%。结论靶向封闭PEG10可下调肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin(CTNNB1)、WNT1表达水平。PEG10对肝癌的促进作用可能部分与其影响Wnt/β-catenin通路有关。; 高燕张厚德张美平林菊生; 关键词：PEG10 WNT/Β-CATENIN 信号转导通路肝癌

原发性肝癌的分子靶向治疗策略被引量：3: 2011年; 原发性肝癌（简称肝癌）是严重危害我国人民健康的重大疾病，具有高发病率、高转移率、高复发率和高病死率的特点。探索新的更有效的肝癌治疗方法一直是研究的热点，也是对目前以外科手术切除和肝移植为主的肝癌综合治疗体系的有益补充和改进。; 何星星任换平黎媛林菊生; 关键词：肝细胞分子靶向治疗

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞羧末端结合蛋白反应蛋白表达的影响: 2011年; 目的研究乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对博莱霉素诱导HepG2细胞DNA双链断裂（DSB）损伤修复关键因子羧末端结合蛋白反应蛋白（CtIP）的影响。方法建立稳定表达HBx的HepG2肝癌细胞株（HepG2-HBx）及空质粒对照细胞株（HepG2-vec）。用博莱霉素诱导细胞DSB损伤后，用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况，用实时定量PCR及Western blot检测CtIP的mRNA与蛋白表达水平，并用激光共聚焦显微镜观察CtIP蛋白在细胞内的定位情况。多组数据采用单因素方差分析和SNK—q检验；两组数据间比较用t检验。结果经检测转染HBx基因的HepG2细胞（HepG2-HBx）能稳定表达HBx。博莱霉素处理后，HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞的凋亡比例分别为16．90％±0．89％和15．30％±0．86％，差异无统计学意义（q=2．074，P〉0．05），但死亡细胞比例分别为8．71％±0．74％和4．90％±0．46％，差异有统计学意义（q=7．126，P〈0．01）；同时两种细胞株都出现了细胞周期G2／M期阻滞，差异有统计学意义（F=11．401，P〈0．05）。HBx使CtIP蛋白表达水平和mRNA表达水平均下调，HeDG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞CtIP蛋白的相对表达量分别为0．66±0．04、0．73±0．05，差异有统计学意义（t=2．314，P〈0．05）;CtIP mRNA相对表达量分别为1．00±0．06、1．23±0．08，差异有统计学意义（t=2．732，P〈0．05）。同时观察到CtIP蛋白主要在细胞胞核内表达。结论HBx能干扰肿瘤抑制蛋白CtIP的表达，可能影响细胞DSB损伤的修复。; 刘庆王梦漪何星星陈曼宋起龙蒋翔谢琼慧林菊生; 关键词：肝细胞乙型肝炎病毒X蛋白 DNA双链断裂

DNA Double-Strand Breaks,Potential Targets for HBV Integration被引量：2: 2010年; Hepatitis B virus(HBV)-induced hepatocellular carcinoma(HCC) is one of the most fre-quently occurring cancers.Hepadnaviral DNA integrations are considered to be essential agents which can promote the process of the hepatocarcinogenesis.More and more researches were designed to find the relationship of the two.In this study,we investigated whether HBV DNA integration occurred at sites of DNA double-strand breaks(DSBs),one of the most detrimental DNA damage.An 18-bp I-SceI homing endonuclease recognition site was introduced into the DNA of HepG2 cell line by stable DNA transfection,then cells were incubated in patients’ serum with high HBV DNA copies and at the same time,DSBs were induced by transient expression of I-SceI after transfection of an I-SceI expression vector.By using nest PCR,the viral DNA was detected at the sites of the break.It appeared that integra-tion occurred between part of HBV x gene and the I-SceI induced breaks.The results suggested that DSBs,as the DNA damages,may serve as potential targets for hepadnaviral DNA insertion and the integrants would lead to widespread host genome changes necessarily.It provided a new site to investi-gate the integration.; 胡晓文林菊生谢琼慧任精华常莹吴文杰夏羽佳; 关键词：INTEGRATION

La蛋白结合位点缺失的HBeAg mRNA在细胞内的稳定性: 2009年; 目的观察乙型肝炎病毒e抗原mRNA(HBeAg mRNA)上La蛋白结合位点的缺失对其细胞内稳定性的影响,从而进一步研究这个位点在乙肝病毒生命周期中的作用。方法针对HBeAg mRNA上La蛋白结合位点,在HBV DNA水平上利用PCR定点突变技术,构建突变型HBV载体,使其转录出来的HBeAg mRNA缺失La蛋白结合位点,将其命名为pHBV-mLa;应用脂质体将突变型HBV载体瞬时转染HepG2细胞,同时将转染了野生型HBV载体的细胞作为对照组;在各组中,用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测HBeAg mRNA,同时酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中HBeAg。结果酶切鉴定和碱基测序证明,成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的突变型HBV载体—pHBV-mLa。转染后半定量RT-PCR检测发现,突变后HBeAg mRNA水平明显低于未突变的对照组,ELISA检测发现突变组中HBeAg表达下调。结论HBV-DNA上引入的突变可以破坏HBeAg mR-NA上La蛋白结合位点,影响HBeAg mRNA在细胞内的稳定性。HBeAg mRNA上La蛋白结合位点对乙肝病毒生命周期至关重要。; 林园园程晓明黎培员常莹宋宇虎林菊生; 关键词：LA蛋白稳定性

MiR-122调控肝癌遗传印记基因PEG10的实验研究被引量：6: 2010年; 目的探讨遗传印记基因PEG10功能的异常与miRNA失调控的相关性。方法通过生物信息学网站TargetScan预测可能参与PEG10调控的miRNA分子，筛选到miR～122。通过基于taqman探针的实时定量逆转录聚合酶链反应，比较miR-122在原代正常肝细胞和3株肝癌细胞株（Huh7，Hep3B，HepG2）中的表达差异。将miR-122的分子前体转染HepG2细胞，观察转染前后PEG10在mRNA和蛋白水平的表达变化。多组均数间比较采用秩和检验，配对样本组间差异比较采用t检验。结果生物信息学预测结果显示，miR-122可能参与了PEG10的调控。实时定量逆转录聚合酶链反应结果显示，PHHC，Huh7、HepG2、Hep3B细胞miR-122的表达量（2^△ △ Ct值）分别为1．0578±0．0975、0．5600±0．0632、0．0068±0．0012、0．0058±0．0008，H=9．667，P〈0．05。与原代正常肝细胞相比，miR-122在肝癌细胞株中表现为完全（Hep3B、HepG2细胞）或部分缺失（Huh7细胞），其表达水平与PEG10呈负相关。将miR-122分子前体转入HepG2细胞后，PEG10在mRNA水平并未显示出明显的下调，但Western blot结果提示miR-122分子前体明显抑制了PEG10蛋白的表达。结论miR-122参与了遗传印记基因PEG10的调控，其调控主要发生在翻译阶段，即蛋白质水平。miRNA的失调控与肝癌的发生密切相关，其功能的异常可能早于受其调控的癌基因或抑癌基因的改变，是肝癌发生的早期事件，这为肝癌的早期预警和基因治疗提供了新思路。; 常莹何星星黎培员林菊生; 关键词：肝细胞基因疗法 MIRNA 遗传印记基因PEG10

Fas配体启动子区-844T／C单核苷酸多态性与重型乙型肝炎转归的关系: 2011年; 目的探讨中国汉族人Fas配体（FasL）基因单核苷酸多态性与重型乙型肝炎之间的关系。方法采用病例一对照研究方法，将HBV感染者作为研究对象。收集相关的非活动性HBsAg携带者233例，重型肝炎患者68例，HBV自发清除者100例，肝硬化患者102例，肝细胞癌患者112例的全血标本及临床相关资料。应用TaqMan探针实时荧光分型PCR方法检测患者Fasl基因-844T／C位点的基因多态性，计算比值比（OR）值及95％可信区间（C1）。结果应用二元Logistic回归分析，控制年龄、性别等因素后，非活动性HBsAg携带者的FasL-844CC、CT、TT基因型频率分别为50．64％、39．91％及9．44％；重型肝炎组中FasL-844CC、CT、TT基因型频率分别为79．41％、17．65％及2．94％。携带FasL-844CC基因型的非活动性HBsAg携带者与重型肝炎的发生呈显著关联（OR=4．729，95％CI：0．510～21．282，P=0．043），而其他病例对照组中存在的关联差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论携带FasI。844CC基因型的非活动性HBsAg携带者易发生乙型肝炎重症化，应对这部分人群给予更多的关注。; 唐锋何星星常莹张家云陈智汪静王俊帅刘翩唐学军林菊生; 关键词：肝炎乙型单核苷酸

人XAF1基因启动子的克隆及其在人肝癌细胞株中活性的测定被引量：1: 2009年; 目的分析XAF1基因启动子在肝癌细胞株中的活性,为研究XAF1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法从肝癌细胞株中扩增XAF1基因的1 395 bp启动区域片段并分别克隆到报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,分别将含有XAF1基因启动子的报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,检测萤火虫荧光素酶的活性并观察绿色荧光蛋白的表达。通过转染细胞、荧光素酶活性测定及观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果重组的质粒经双酶切和测序结果证实克隆的XAF1启动子片段序列正确;转染后的HepG2、SMMC7721荧光素酶相对发光强度分别是6.97±0.74、6.12±0.59。其绿色荧光蛋白强度明显低于对照组。结论本实验构建的含XAF1启动子的报告基因质粒为研究XAF1基因的转录调控提供实验依据。; 陈琼余琴汪志军里进胡晓文王晶常莹林菊生; 关键词：基因 XAF1 启动区转录调控

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