国家自然科学基金(30671882)
- 作品数：14 被引量：38H指数：3
- 相关作者：张丽芳朱珊丽薛向阳李玲玲欧琴更多>>
- 相关机构：温州医学院郧阳医学院温州医学院附属第二医院更多>>
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- EB病毒潜伏膜蛋白2的二级结构分析和B细胞表位预测被引量：14
- 2007年
- 目的:预测EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的二级结构和B细胞表位。方法:以EBV标准株(B95.8)LMP2的完整氨基酸序列为基础,采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN四种方法分别预测LMP2的二级结构;并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等进行综合分析,预测EBV LMP2的B细胞优势表位。结果:四种方法对EBVLMP2二级结构的预测均表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。B细胞优势表位可能位于其N端199～209、318～322和381～391区段。结论:用多参数预测EBV LMP2的二级结构和B细胞优势表位,可为其单克隆抗体的制备和表位疫苗设计等研究提供理论依据。
- 欧琴朱珊丽张丽芳
- 关键词：EBV潜伏膜蛋白2B细胞表位
- 人乳头瘤病毒16型次要结构蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究被引量：3
- 2010年
- 目的制备高效价人乳头瘤病毒(HPV)16型次要结构蛋白(L2)特异性兔血清抗体,并对其效价及其与HPV16 L2蛋白结合的特异性进行鉴定。方法将重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2转化至E.coliBL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白的抗原性;经镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化HPV16 L2全长融合蛋白,纯化蛋白用佐剂乳化后经日本大耳白家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周后加强免疫,共2次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取血,采用Western blot检测血清抗体的特异性,采用ELISA法检测血清抗体水平及变化趋势。结果家兔用HPV16 L2融合蛋白全程免疫后均产生了抗HPV16 L2抗体,ELISA法检测最高滴度达1∶256 000;Western blot检测显示,该抗体能识别HPV16 L2蛋白。结论用原核HPV16 L2全长蛋白免疫家兔,可获得高效价的血清抗体,该抗体具有与HPV L2蛋白结合的特异性。
- 李玲玲周珠哈朱珊丽薛向阳张丽芳
- 关键词：人乳头瘤病毒16型抗体
- 温州地方株HPV16型L1基因多态性及蛋白特性分析被引量：8
- 2009年
- 目的:了解温州地方株HPV16 L1基因结构特点,分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化,为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据。方法:设计HPV16型L1基因特异性引物,从宫颈癌组织标本提取DNA,进行PCR扩增鉴定,PCR产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNAStar软件分析HPV16型L1基因多态性及蛋白特性变化情况。结果:测定的序列与标准基因序列(NC 001526)比较,温州地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为99.1%～99.8%,分别形成8种突变模式,其中3处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也相应发生变化,但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上与标准株相比较无明显变化。结论:温州地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异。
- 陈俊董海艳朱珊丽欧琴张丽芳
- 关键词：人乳头瘤病毒L1基因基因多态性
- Polymorphism Of The L1 Capsid Gene Of Human Papillomavirus Type 6b,11 And 16 In Patients With Genital Warts And Cervical Cancer In Wenzhou,China.
- ＜正＞Human Papillomavirus（HPV）vaccines based on virus-like particles（VLPs）,which made from the major capsid prot...
- Shan-li Zhu Qin Ou Jun Chen Li-fang Zhang Department of Microbiology and ImmunologyInstitute of molecular virology and immunology
- 文献传递
- 人乳头瘤病毒L2氨基端蛋白的同源性及其交叉反应特性研究
- 2010年
- 目的 研究人乳头瘤病毒（HPV）次要衣壳蛋白（L2）在临床常见HPV感染型别中的同源性及其交叉反应特性.方法 采用生物信息学方法对临床常见HPV感染型别中的L2氨基酸序列进行比对,发现其氨基端1～200序列具有高度同源性.采用PCR法从宫颈癌患者组织DNA中扩增HPV16 L2（1～200）肽段的碱基序列,将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1得到重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2（1～200）.将测序鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21（DF3）中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定;进一步通过Western blot检测HPV16L2（1～200）融合蛋白与HPV6、11、16和18型DNA检测阳性临床患者血清的特异性结合能力;以镍螯合亲和层析柱（Ni-NTA Agarose）纯化的HPV16 L2（1～200）融合蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA法对98例尖锐湿疣患者、135例宫颈癌患者及96例健康对照者血清进行特异性血清IgG抗体检测.结果 在HPV6、11、18、35等14个临床常见型别中,与HPV16 L2的1～200间的氨基酸序列比较,同源性达到52.7%～74.3%;成功构建了含有HPV16 L2（1～200）的重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2（1～200）,含有HPV16 L2（1～200）的融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达,表达量占总蛋白的22.6%;表达产物的相对分子质量（Mr）约49×103,与预期Mr相符;以HPV6、11、16和18 DNA阳性患者血清为一抗进行Western blot分析,结果显示,在Mr约49×103处出现特异性条带.ELISA结果显示,尖锐湿疣组、宫颈癌组患者血清及健康对照者血清抗体均值分别为0.753±0.262、0.756±0.274和0.178±0.157,阳性率分别为89.8%、88.9%和9.4%.三组间血清抗体均值及阳性率比较差异均具有统计学意义（P均＜0.001）,而尖锐湿疣组和宫颈癌组间的血清抗体均值比较差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 HPV L2 N端1～200氨基酸序列具有高度同源性,并在HPV6、11、16和18型别间具有交�
- 李玲玲赵朋云王佳周珠哈朱珊丽薛向阳张丽芳
- 关键词：人乳头瘤病毒同源性
- HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测被引量：1
- 2010年
- 目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。
- 吴永琴陈军朱珊丽孟锐锋陆丽君张丽芳
- 关键词：HPV18宫颈癌ELISA血清特异性抗体
- EB病毒潜伏膜蛋白2的B细胞表位免疫原性研究被引量：3
- 2010年
- 目的 分析EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2（LMP2）B淋巴细胞表位的免疫原性.方法 利用生物信息学技术筛选出EBV LMP2可能的优势B淋巴细胞表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391,将其相应基因片段分别克隆至pET32a（＋）载体并转化至大肠埃希菌BL21（DE3）菌株诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹分析鉴定,通过Ni-NTA离子螯合亲和层析柱纯化.分别以纯化的表位蛋白作为免疫原,皮下多点注射BALB/c小鼠,设pET32a（＋）蛋白和PBS为对照.分别以3个表位蛋白作包被抗原,ELISA法检测第0、3、6周小鼠血清中相应表位特异性抗体IgG,并于免疫后第6周检测各免疫组小鼠血清抗体识别天然EBV抗原的能力.结果 在原核表达体系中分别获得了表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391融合表达产物.纯化的表位蛋白免疫小鼠,血清中分别能检测到相应的表位特异性抗体IgG,其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势,表位LMP2318-322免疫组第3、6周小鼠血清抗体显著高于pET32a（＋）蛋白对照组（F=493.85、773.99,均P＜0.05）,LMP2381-391免疫组第3、6周抗体水平亦显著高于pET32a（＋）蛋白对照组（F=926.33、309.14,均P＜0.05）,而表位LMP2199 209免疫组至第6周特异性抗体高于pET32a（＋）蛋白对照组（F=87.27,P＜0.05）.3个表位蛋白免疫小鼠血清抗体IgG均能识别EBV天然抗原,以表位LMP2199-209和LMP2381-391免疫组抗EBV-IgG生成水平尤为显著.结论 筛选的EBV LMP2可能的优势B淋巴细胞表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391通过原核表达体系中制备的表位蛋白,具有较好的免疫原性,可进一步用于EBV感染及其相关肿瘤表位疫苗的研究.
- 李文姝郑美霞欧琴朱珊丽张丽芳
- 关键词：病毒包膜蛋白质类
- 尖锐湿疣患者血清及宫颈分泌物HPV6bE7抗体检测方法的建立及流行病学意义被引量：2
- 2010年
- 目的建立尖锐湿疣（CA）患者血清和宫颈分泌物人乳头瘤病毒（HPV）6b型E7特异性抗体检测方法。方法利用PCR扩增HPV6bE7全长基因，构建重组原核表达质粒pET32a（＋）／HPV6bE7，原核表达产物采用SDS—PAGE和Western blot进行鉴定。进一步经镍螯合亲和层析法（Ni—NTAAgarose）纯化后作为包被抗原，以间接ELISA方法分别对56例CA患者、81名健康对照者的血清和宫颈分泌物标本巾的特异性抗体进行检测，另取43例宫颈癌患者的血清标本作为对照；同时用PCR方法对56例CA组织标本进行HPV6bDNA的检测。结果从CA组织标本中扩增的HPV6bE7全长基因与标准序列（GenBank登录号：NC001355）同源性为99．5％。HPV6bE7融合蛋白在原核表达系统中得到了较高效的表达（40μg／ml）。经间接ELISA检测，CA组血清特异性IgG抗体水平明显高于宫颈癌组和健康对照组（P〈O．05），吸光度（A）均值分别为1．82±0．48、1．36±0．39和1．39±0．27。CA组宫颈分泌物特异性slgA抗体水平亦显著高于健康对照组（P〈0．05），A值分别为O．63±0．26和0．53±0．06。经PCR检测，CA患者组织HPV6bE7DNA阳性率为78．6％（44／56）。与PCR检测结果比较，HPV6bE7特异性IgG和sIgA抗体用于检测CA患者HPV6b感染的敏感性分别为68．2％（30／44）、54．6％（24／44），特异性均为100％（12／12）。结论CA患者血清和宫颈分泌物HPV6bE7特异性抗体，用于诊断HPV6b感染具有一定的敏感性和较高的特异性，可用于HPV6b感染的流行病学调查。
- 钟晓芝陈韶朱珊丽薛向阳李文妹王乐丹张丽芳
- 关键词：尖锐湿疣人乳头瘤病毒血清宫颈分泌物
- EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析被引量：1
- 2010年
- 目的 对EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2（LMP2）中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法 利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a（＋）得到pET32a（＋）/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21（DE3）表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2（aa195-232）和LMP2（aa419-436）肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量（Mr）约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比（1：5,1：10,1：25）增加,CTL杀伤活性逐渐增强（12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%）,同时产生了特异性血清IgG抗体反应（A490=0.258±0.040）,与对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 本研究设计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.
- 陆丽君李玲玲刘建晓王佳朱珊丽陈筱菲张丽芳
- 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白表位
- EB病毒潜伏膜蛋白2A_(1-119)重组质粒的表达及鉴定
- 2010年
- 目的:构建含EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白(LMP)2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论:EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。
- 张琴薛向阳夏克栋李文姝陈韶张丽芳
- 关键词：PGEX-4T-1原核表达
