国家自然科学基金(30570972)
- 作品数：10 被引量：19H指数：3
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- Wnt-1重组腺病毒的构建及其对人表皮干细胞分化的影响
- 2008年
- 目的构建Wnt-1重组腺病毒，并观察Wnt-1对人表皮干细胞分化相关蛋白表达的影响。方法连接穿梭质粒与骨架质粒，构建重组腺病毒；扩增后感染人表皮干细胞，检测其3种角蛋白和基质金属蛋白酶（MMP）-2的表达。结果重组质粒酶切后可得到30kb和4．5kb两条特异性条带；人表皮干细胞感染重组腺病毒后，聚合酶链反应（PCR）与绿色荧光蛋白均指示Wnt-1基因的表达，且角蛋白10表达变为阳性；角蛋白18表达增强；角蛋白19表达减弱；细胞培养基中MMP-2浓度由（-16．25±2．40）μg/L升高至（714．88±30．45）μg/L（t=58．45，P〈0．01）。结论Wnt-1具有促使人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的趋势。
- 李元朝伍津津张一杨涛杨桂红王兵强
- 关键词：WNT-1腺病毒载体表皮干细胞
- 不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的增殖分化能力比较
- 2013年
- 目的比较三维条件下不同代次角质形成细胞构建的表皮形态及增殖分化情况。方法采用不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤，通过苏木精-伊红（HE）和高碘酸-希夫（PAS）染色，观察各组组织工程皮肤的结构形态；并利用角蛋白CK1／CK10、CK5／CK14、细胞增殖核抗原Ki-67免疫组织化学染色，比较各组组织工程皮肤表皮的增殖分化能力。结果不同代次角质形成细胞构建的组织工程皮肤都有明显的表皮真皮结构。1、2代较其他代次分层情况好，2代表皮层厚度明显高于其他代次（P〈0．05）。加Ⅳ型胶原组的表皮真皮间黏附的紧密程度高于未加Ⅳ型胶原组，Ⅳ型胶原对表皮的厚度影响不大（P〉0．05）。Ⅳ型胶原组PAS染色阴性，说明单独加Ⅳ型胶原不能形成基底膜结构。2代角质形成细胞Ki-67增殖系数接近正常皮肤，其余各代次角质形成细胞的增殖系数逐渐减少（P〈0．05）。CK1／CK10、CK5／CK14在1、2代皮肤中阳性表达明显，其余代次对于两种角蛋白的表达并不明显。结论3代以前角质形成细胞有更好的增殖分化能力，更适合作为组织工程皮肤的种子细胞。
- 徐巧瑜杨桂红杨涛王端鲁元刚伍津津
- 关键词：角质形成细胞组织工程皮肤CK10
- 氯化乙酰胆碱对培养的汗腺上皮细胞内游离钙的调节作用被引量：2
- 2006年
- 目的探讨氯化乙酰胆碱对体外培养的人汗腺上皮细胞内游离钙浓度的作用。方法酶消化法培养人汗腺上皮细胞。钙荧光探针Fura 3-AM染色,在原代和第1代细胞高钙或无钙培养液中加入氯化乙酰胆碱后,激光共聚焦观察其细胞内游离钙离子[Ca^(2+)]；变化情况。结果细胞生长良好,约3周左右长满瓶底。细胞外液钙浓度高时(2 mmol/L),加入氯化乙酰胆碱后原代和第1代汗腺上皮细胞的钙通道开放,钙内流,细胞内钙浓度增加,后逐渐下降,但仍高于正常。细胞外液无钙时,氯化乙酰胆碱不能刺激细胞内游离钙增加。结论体外培养的原代和第1代汗腺上皮细胞在氯化乙酰胆碱的刺激下,钙通道开放,细胞外的钙内流引起细胞内游离钙升高,而非细胞内结合钙转变成游离钙引起钙浓度增高。
- 雷霞伍津津鲁元刚朱堂友龙在云刘媛
- 关键词：汗腺钙乙酰胆碱
- 外源性人端粒酶逆转录酶基因转染对正常人毛乳头细胞的影响被引量：4
- 2008年
- 目的研究外源性人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因转染对体外培养正常人毛乳头细胞的影响。方法采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。检测转染细胞内hTERT基因的整合和表达情况,初步分析转染细胞的生物学特性。结果转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,传代次数增加,已连续传至35代。检测证实转染细胞内hTERT基因在DNA、mRNA和蛋白质水平均有表达,且此转染细胞具有体外培养正常毛乳头细胞的生物学特性。结论外源性hTERT基因转染可以延长体外培养正常人毛乳头细胞的寿命且可保持其正常的生物学特性。
- 刘官智伍津津朱堂友鲁元刚杨亚东杨桂红
- 关键词：毛乳头细胞端粒酶人端粒酶逆转录酶转染
- hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征被引量：1
- 2008年
- 目的探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征。方法采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。应用RT-PCR法检测hTERT mRNA的表达。采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征。结果转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代。检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性。结论hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征。
- 刘官智伍津津朱堂友鲁元刚杨亚东杨桂红
- 关键词：毛乳头细胞人端粒酶逆转录酶永生化
- hTERT基因转染激活人毛乳头细胞端粒酶的实验研究被引量：3
- 2008年
- 目的:明确外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染能否激活体外培养人毛乳头细胞(DPC)的端粒酶。方法:采用脂质体转染法,将空载体质粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT分别导入体外培养的正常人DPC,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。应用反转录(RT)-PCR法检测hTERTmRNA的表达,端粒重复序列扩增(TRAP)-ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果:未转染DPC和空载体转染细胞(DPC-EGFP)无hTERTmRNA表达,端粒酶活性为阴性;而外源性hTERT基因转染细胞(DPC-hTERT)稳定表达hTERTmRNA,同时端粒酶活性转为阳性。结论:外源性hTERT基因转染能够激活体外培养人DPC的端粒酶,为建立永生化细胞系奠定基础。
- 刘官智伍津津朱堂友鲁元刚杨桂红
- 关键词：毛乳头细胞基因HTERT端粒酶人端粒酶反转录酶
- 微载体技术高效扩增人毛乳头细胞的培养被引量：1
- 2007年
- 目的探讨用微载体培养技术进行人毛乳头细胞高效扩增的培养方法，以满足对毛乳头细胞的大量需求。方法采用Cytodex-3为培养载体进行人第3代毛乳头细胞的微载体培养，定期观察培养液颜色的变化，采用苔盼蓝染色进行活细胞计数，倒置显微镜下观察生长状况。将微载体上消化的细胞进行传统培养，观察细胞生长情况，甲苯胺蓝染色，细胞免疫组织化学染色。结果培养至第12天，微载体上细胞数量最多，并且细胞聚集成团，类似毛乳头样结构。利用这时的细胞进行普通培养，仍然表现出凝集性生长特点，细胞呈异染性，免疫组织化学染色阳性。结论利用Cytodex-3培养可以收获大量具有生物活性的毛乳头细胞。
- 张教扬伍津津鲁元刚朱堂友杨桂红
- 关键词：毛乳头细胞微载体免疫组织化学染色
- 肝细胞生长因子对人外泌汗腺上皮细胞促增殖作用的研究被引量：3
- 2008年
- 目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对培养的人外泌汗腺上皮细胞(human eccrinesweat gland epithelial cells,hESGc)的促增殖作用,以及细胞内磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-ERK1/2)蛋白的表达。方法在无血清角质形成细胞培养基(keratinocyte serum free medium,KSFM)中培养hESGc,取第1代细胞进行实验。免疫组织化学染色检测C-met表达。MTT法检测HGF对hESGc的促增殖作用,实验分为3组:空白组、对照组和实验组。空白组仅含200μL KSFM;对照组于96孔板以2×103个/孔接种hESGc,并加入200μLKSFM;实验组于96孔板以2×103个/孔接种hESGc并加入200μLKSFM后,再分别加入不同浓度(2、20、40、80ng/mL)HGF。实验组于加入各浓度HGF前以及加入后2、4d,观察细胞增殖情况。实验组于加入40ng/mL HGF后即刻,5、30、90和120min,采用Westernblot方法检测细胞内p-ERK1/2表达规律。结果hESGc抗-C-met免疫组织化学染色胞浆可见阳性染色,细胞核染色为蓝色。MTT法检测示40、80ng/mL HGF对hESGc具有显著促增殖作用(P<0.05)。在含40ng/mL HGF的KSFM中培养2d,吸光度(A)值为0.2393±0.0709,增殖率为74.2%,对照组A值为0.1374±0.0290;培养4d,40ng/mL HGF实验组A值为0.2878±0.0743,增殖率为74.8%,对照组A值为0.1646±0.0350,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在含80ng/mL HGF的KSFM中培养2d,A值为0.2123±0.0592,增殖率为54.5%;培养4d,80ng/mL HGF实验组A值为0.2310±0.0567,增殖率为40.3%;与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。p-ERK1/2在40ng/mL HGF刺激5min后表达达高峰,相对积分吸光度值(relative integral absorbance,RIA)为0.5932±0.1922,较刺激后即刻增加8.1倍(P<0.01);刺激30、90及120min后RIA与刺激后即刻比较,差异无统计学意义(P>0.05)结论HGF可促进hESGc增殖,并能引起ERK1/2蛋白磷酸化。
- 雷霞伍津津鲁元刚朱堂友杨亚东
- 关键词：肝细胞生长因子上皮细胞增殖体外培养
- 表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性及分选方法的研究被引量：5
- 2009年
- 目的观察不同时间内表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性。方法分别取贴壁后10、20、30、60min的人角质形成细胞,用细胞计数器进行细胞计数,计算其直径。并用β1整合素、K19对贴壁的细胞进行鉴定。流式细胞仪检测β1整合素的阳性表达量,相差显微镜进行细胞形态学观察。结果随着时间的延长,表皮干细胞贴壁数逐渐增多,20min内黏附细胞数与10min内比较差异有统计学意义(P<0.05),而与30、60min内比较差异无统计学意义。贴壁细胞小而圆,反光能力强,整合素β1间接免疫荧光及免疫组化结果显示贴壁细胞均为阳性,K19免疫组化阳性率为31.03%,流式细胞仪测整合素β1阳性率表达量为100%。结论20min内Ⅳ胶原能快速黏附绝大部分表皮干细胞,细胞活力不受影响,可以用于表皮干细胞的分选。
- 崔洪勋伍津津唐书谦杨桂红李元朝
- 关键词：表皮干细胞细胞分选
- Wnt-1重组腺病毒对人表皮干细胞分化的影响被引量：1
- 2008年
- 目的了解Wnt-1重组腺病毒对人表皮干细胞（ESC）分化趋势的影响。方法将Wnt-1重组腺病毒导入人ESC（实验组）后，检测细胞直径及增殖情况、ESC多种分子标记物的表达、培养上清液中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-7的含量。以正常ESC为对照组。结果对照组、实验组ESC直径接近（P〉0．05）。对照组ESC为（1．18±0．10）×10^5个／mL，实验组为（1．45±0．09）×10^5个／mL，后者明显高于前者（P〈0．05）。2组ESC分子标记物角蛋白5（K5）、K6、K7、K8、K14、CD44、癌胚抗原、雌激素受体、孕激素受体的表达量组间比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；对照组K10表达量为0，实验组为（60±3）％；对照组K18为（13．8±1．7）％，实验组表达明显增强[（34．3±2．1）％，P〈0．05]；对照组K19为（24．4±1．5）％，实验组减弱至（17．1±1．8）％（P〈0．05）。实验组ESC培养上清液中MMP-2和MMP-7含量均明显高于对照组（P〈0．01）。结论Wnt-1重组腺病毒具有诱使人ESC向腺样上皮细胞分化的趋势。
- 李元朝伍津津毕建军杨涛杨桂红王兵强
- 关键词：细胞分化重组腺病毒表皮干细胞
