湖北省自然科学基金(2008CDB188)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：祝建芳刘朝董继华卢银平郭涛更多>>
- 相关机构：华中科技大学更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金湖北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达被引量：2
- 2009年
- 目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析。方法:限制性内切酶EcoRV酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1:640。结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析。
- 卢银平郭涛祝建芳刘朝董继华
- 关键词：基因表达基因克隆
- 高效表达型T克隆载体的构建及其特性被引量：1
- 2009年
- 目的研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析。方法限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭α干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果成功构建了表达型T载体,外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFNA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达1∶640。结论新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析。
- 卢银平祝建芳刘朝董继华
- 关键词：基因克隆基因表达
