江苏省科技支撑计划项目(BE2012368)
- 作品数：10 被引量：42H指数：4
- 相关作者：姜平白娟王先炜李玉峰董彦鹏更多>>
- 相关机构：南京农业大学中国畜牧兽医学会江苏南农高科技股份有限公司更多>>
- 发文基金：江苏省科技支撑计划项目国家生猪现代产业技术体系建设项目国家公益性行业科研专项更多>>
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- 猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用被引量：3
- 2014年
- 用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值<0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。
- 时晓丽谈晨赵攀登白娟李玉峰姜平
- 关键词：猪流行性腹泻病毒抗体
- 猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：4
- 2014年
- 采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×10^5以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。
- 时晓丽谈晨赵攀登白娟李玉峰姜平
- 关键词：猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体
- 猪圆环病毒病免疫防控关键技术的创建与应用
- 2019年
- 猪圆环病毒病是因猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的一种全球性重要猪传染病。该病1997年在加拿大暴发,快速传播至欧美亚等国家或地区,发病率达40%~50%,死淘率在20%以上。由于存在病毒培养滴度低、疫苗抗原规模化制备技术瓶颈及诊断技术准确性低等世界性关键技术难题,加上该病毒感染和免疫机制不清,国内外长期缺乏有效的防控措施,成为制约我国养猪业持续健康发展的重要疾病。
- 姜平王先炜王先炜蒋伟弼白娟张书霞李玉峰董彦鹏陈溥言张书霞何海蓉
- 关键词：猪圆环病毒病免疫机制猪圆环病毒2型病毒感染
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用被引量：5
- 2014年
- 利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。
- 翟淑燕陈兴慧白娟王先炜姜平
- 关键词：猪圆环病毒2型CAP蛋白中和活性单克隆抗体夹心ELISA
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及在小鼠体内免疫特性研究被引量：2
- 2016年
- 猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因是该病毒基因工程疫苗的重要目的基因,但其在大肠杆菌表达系统中的表达产物通常以包涵体形式存在,影响其作为亚单位疫苗使用的免疫保护作用。将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子,或构建MPG与ORF2基因融合,分别克隆至表达载体p ET28a,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果证实改造后的PCV2 Cap蛋白基因实现了可溶性表达。将上述两种重组蛋白纯化后,分别与GEL01、ISA206或ISA15A三种佐剂混合配制疫苗,小鼠免疫保护试验结果证明,以GEL01为佐剂的两免疫组PCV2 ELISA抗体和中和抗体水平最高。攻毒试验结果显示,除ISA15A组外,其他各免疫组脾脏中PCV2含量都显著低于非免疫对照组,表明两种重组蛋白与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗可诱导产生一定水平的免疫保护作用,为PCV2亚单位疫苗的研制奠定了基础。
- 刘盼娆周雪晨朱雪蛟白娟王先炜姜平
- 关键词：PCV2CAP蛋白可溶性表达免疫特性
- 猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌5型二联灭活疫苗研制与免疫效力研究被引量：2
- 2015年
- 猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPs)混合感染十分普遍,造成我国养猪业严重经济损失。本研究将杆状病毒表达的重组PCV2 Cap蛋白(BCap)和PCV2灭活病毒液(i PCV2),分别与HPs血清5型(HPs5)灭活菌液混合,加入水性佐剂混合制备成BCap/HPs5与i PCV2/HPs5二联灭活疫苗,进行猪体免疫保护试验。仔猪免疫保护试验结果为:两种疫苗免疫后均可诱导猪体产生PCV2和HPs抗体。免疫后35天用PCV2攻击,两免疫组猪均无明显临床症状,相对日增重(RDWG)与空白对照组相似,但高于攻毒对照组(P<0.05);攻毒后14天,病毒血症明显低于攻毒对照组(P<0.05);攻毒后28天剖解,腹股沟淋巴结PCV2载量明显低于攻毒对照组(P<0.05),病理学变化明显轻于攻毒对照组。免疫后35天用HPs攻击,对照组猪均出现明显临床症状,但两免疫组猪无明显临床症状;攻毒后14天剖检,两免疫组病理学变化方面相似,但明显轻于攻毒对照组。结果表明,BCap/HPs5与i PCV2/HPs5两种二联苗免疫仔猪后均能诱导机体产生免疫应答,产生免疫保护作用,具有较好应用前景。
- 徐蓉白娟刘捷王先炜董彦鹏姜平
- 关键词：猪圆环病毒2型副猪嗜血杆菌免疫保护
- 猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用被引量：2
- 2014年
- 为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保存期测定。结果显示,其敏感性高,特异性强,批内批间重复性好,与商品化试剂盒符合率高,保存期长且性质相对稳定。先后制备了5个批次的阻断ELISA试剂盒,用于检测PCV2不同疫苗免疫猪血清、规模猪场PMWS发病猪及同群健康猪血清、不同日龄猪群血清.结果显示,PCV2油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高,PWMS发病猪血清抗体水平高于同群健康猪,猪群中育肥猪血清抗体水平最高。
- 王丽敏杨香林侯成才王先炜姜平
- 关键词：猪圆环病毒2型CAP蛋白阻断ELISA
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位序列对其在毕赤酵母中表达的影响被引量：5
- 2014年
- 为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因中核定位序列(NLS)对Cap蛋白免疫特性的影响,以酵母偏嗜密码子优化的Cap基因为模板,采用PCR方法分别构建包含完整的和删除NLS的Cap基因的重组酵母载体,并转化至GS115宿主菌,经筛选获得GS115-pPIC9K-Capo和GS115-pPIC9K-CapoΔNLS重组菌株。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达产物Capo和CapoΔNLS均具有Cap蛋白的抗原性,大小分别约为43ku和27ku。电镜观察结果显示,仅Capo可以形成病毒样颗粒。小鼠免疫试验结果显示,CapoΔNLS和Capo诱导的ELISA抗体水平相似,但CapoΔNLS免疫组中和抗体水平明显低于Capo组(P<0.05)。结果表明,Cap NLS对其在酵母中表达产物病毒样颗粒的形成及中和抗原特性有重要影响,从而为PCV2酵母表达亚单位疫苗的研发奠定了基础。
- 侯成才何庆东王丽敏王先炜姜平
- 关键词：猪圆环病毒2型毕赤酵母亚单位疫苗
- 鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR的建立与应用被引量：4
- 2015年
- 为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL;与猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等没有交叉反应性。用该方法对采自我国华东地区的125份断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的淋巴组织样品进行检测,结果显示,单独感染PCV2a占8.0%(10/125),PCV2b占41.6%(52/125),PCV2a或PCV2b共感染占50.4%(63/125)。选取PCV2a或PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR的检测结果一致,说明本研究建立的PCR可以有效鉴别PCV2a与PCV2b,具有较高的特异性和敏感性,可用于断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的临床样品中PCV2的快速检测。
- 朱雪蛟白娟王先炜姜平
- 关键词：PCR
- 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查被引量：15
- 2013年
- 为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到55.32%,病料阳性率达到57.52%。ORF3基因测序分析显示:11个流行病毒株ORF3全基因序列大小均为675 bp,编码224个氨基酸。11个流行株ORF3基因同源性为95.9%～99.9%,编码氨基酸同源性为96.4%～100%。与欧洲代表性强毒株CV777基因同源性为96.3%～97.0%,编码氨基酸同源性为95.1%～96.4%,与CV777弱毒疫苗株基因同源性为96.8%～97.6%,编码氨基酸同源性为92.3%～93.4%,并且无疫苗病毒株ORF3基因的49个碱基缺失。与韩国病毒株比较,其基因同源性为95.0%～98.5%,编码氨基酸同源性为95.5%～99.6%。基因遗传进化树分析表明,国内外PEDV株可分为4群。我国主要流行病毒株属于第1群,与韩国病毒株亲缘关系较近,而与我国疫苗病毒株存在较大差异。该研究表明,PEDV可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一,我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异。
- 董彦鹏白娟范宝超李玉峰姜平
- 关键词：猪流行性腹泻病毒RT-PCRORF3
