国家自然科学基金(39770842)
- 作品数：9 被引量：17H指数：3
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- 创伤后增生性疤痕中α1(Ⅰ)及(Ⅲ)型前胶原基因片段的克隆及鉴定被引量：1
- 2000年
- 【目的】胶原蛋白是构成细胞外基质的主要组分之一 ,它的过量沉积是创伤后增殖性瘢痕形成的原因之一 ,本实验的目的就是要克隆出疤痕中α 1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因片段并进行鉴定。【方法】本研究根据α 1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因的核苷酸序列分别设计 3条引物 ,从瘢痕组织中经RT PCR分别扩增Ⅰ及Ⅲ型前胶原基因的第 2外显子 (Exon 2 )区域的基因片段 (ⅠF2 ,ⅢF2 ) ,克隆到T载体 (pGEM Tvector)。得到阳性重组质粒后经限制性内切酶酶切 ,PCR及测序加以证实。【结果】分别获得长度约为 12 9bp的DNA片段 (简称为ⅠF2 ) ,与长度约为 189bp的DNA片段 (简称为ⅢF2 ) ,与预期片段大小一致。得到重组质粒 pT Ⅰ及 pT Ⅲ ,并得到证实。【结论】获得的α1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因片段是预期所要得到的正确片段。
- 朱家源徐兵苏爱云郭浩光朱斌唐庆
- 关键词：前胶原基因基因扩增
- Ⅰ型及Ⅲ型前胶原核酶对裸鼠增生性瘢痕的干预
- 2005年
- 目的:观察Ⅰ,Ⅲ型前胶原核酶对裸鼠增生性瘢痕的作用效果。方法:实验于2004-02/06在中山大学医学院实验动物中心、电子显微镜室及第一附属医院外科实验室进行。①建立裸鼠增生性瘢痕动物模型(80只)。②将裸鼠随机分为实验组Ⅰ型组20只,注射Ⅰ型前胶原核酶;Ⅲ型组20只,注射Ⅲ型前胶原核酶;Ⅰ型+Ⅲ型组20只,注射Ⅰ型及Ⅲ型前胶原核酶;各组又分为2.5μg/100μL及5.0μg/100μL两个剂量组,每个剂量组各10只裸鼠。对照组:生理盐水组10只,注射生理盐水;空白对照组10只。于建立模型的第4周开始,实验组与生理盐水组每天用微量注射器行瘢痕内多位点注射1次,共7d;第6周取材。③应用苦味酸-天狼猩红染色偏振光法,结合图像分析技术,观察分析各组胶原含量及分布的改变。④电子显微镜观察各组实验前后超微结构的改变。结果:①各实验组瘢痕体积均缩小;Ⅰ型组、Ⅰ型+Ⅲ型组实验后与实验前比较体积明显缩小[Ⅰ型组2.5μg/100μL:(25.6±1.2),(28.3±2.1)mm3,5.0μg/100μL:(27.9±3.0),(30.4±1.7)mm3;Ⅰ型+Ⅲ型组2.5μg/100μL:(24.8±1.6),(29.5±3.3)mm3,5.0μg/100μL:(24.6±1.7),(27.8±1.8)mm3,t=1.981～2.025,P<0.05]。②Ⅰ型组、Ⅰ型+Ⅲ型组与对照组相比Ⅰ型胶原纤维分布明显减少。③生理盐水、空白对照组具有典型的增生性瘢痕的特点,各实验组瘢痕形态改变不明显。④实验组及对照组的超微结构改变无明显差异。结论:Ⅰ和Ⅲ型前胶原核酶均可有效地减少裸鼠增生性瘢痕中胶原的含量。
- 张涛朱家源朱斌林玉坤李新强唐冰
- 关键词：瘢痕
- Ⅰ型与Ⅲ型前胶原核酶治疗裸鼠增生性瘢痕的比较
- 2005年
- 目的:比较Ⅰ型与Ⅲ型前胶原核酶治疗裸鼠增生性瘢痕后成纤维细胞超微结构及胶原形态的改变。方法:(1)建立裸鼠增生性瘢痕动物模型(60只)。(2)将裸鼠随机分为:实验组(A组,20只,注射Ⅰ型前胶原核酶;B组,20只,注射Ⅲ型前胶原核酶;各组又分为2.5μg/100μL及5.0μg/100μL两个剂量组,每个剂量组各10只裸鼠,每天用微量注射器行瘢痕内多位点注射一次,共7d。)及对照组(C组,10只,注射生理盐水,共7d;D组,10只,空白对照组)。(3)应用苦味酸-天狼猩红染色偏振光法,结合图像分析技术,观察分析各组胶原含量及分布的改变。(4)电子显微镜观察各组实验前后超微结构的改变。结果:A、B组实验后瘢痕体积缩小,A组有统计学意义(P<0.05),B组无统计学意义(P>0.05);两组胶原含量均减少(P<0.05);但以分布情况而言,Ⅰ型胶原减少较Ⅲ型胶原明显;两组超微结构改变无明显差异;C组和D组无明显变化。结论:Ⅰ、Ⅲ型前胶原核酶治疗裸鼠增生性瘢痕后,两者均使相应的胶原排列分布及含量减少,形态改变明显,但Ⅰ型减少较Ⅲ型明显;而两者超微结构改变无明显差异。
- 张涛朱家源朱斌林玉坤李新强唐冰
- 关键词：瘢痕核酶
- 苦味酸-天狼猩红偏振光法对疤痕动物模型的鉴定被引量：2
- 2004年
- 目的:运用组织学方法对裸鼠疤痕动物模型进行鉴定。方法:选取15只4～6周龄裸鼠,建立疤痕 动物模型;疤痕移植后4～6周处死动物,取移植物行苦味酸 天狼猩红染色偏振光观察组织特点。结果:移植 物与临床取材特性一致,符合增生性疤痕特点。结论:苦味酸 天狼猩红染色偏振光检测瘢痕组织胶原是对增 生性瘢痕组织测定的简便、有效手段;运用裸鼠建立疤痕动物模型是行之有效的、稳定的。
- 朱斌朱家源张涛唐冰李新强郑树森陈东张伟李爽
- 关键词：裸鼠动物
- Ⅰ型和Ⅲ型前胶原基因核酶抑制增生性瘢痕的实验被引量：1
- 2006年
- 目的:在细胞及动物体内证实前期已合成,并证实其活性的、针对I型和Ⅲ型前胶原基因的核酶的有效性。方法:实验于2004-01/08在中山大学附属第一医院烧伤科、中山大学附属第一医院外科实验室、广州市红十字会医院创伤研究所、中山大学医学院动物实验中心完成。选取80只SPF级4～6周龄裸鼠,体质量15～25g。随机分为注射Ⅰ型前胶原核酶A组、注射Ⅰ型前胶原核酶B组、注射Ⅲ型前胶原核酶C组、注射Ⅲ型前胶原核酶D组、注射Ⅲ型前胶原核酶E组、注射Ⅲ型前胶原核酶F组、对照组G组和空白对照组H组,每组10只。注射Ⅰ型及Ⅲ型前胶原核酶A-F组,7d。对照组G组注射生理盐水7d。应用苦味酸-天狼猩红染色偏振光法,观察分析各组胶原相对含量及分布的改变。同期选取增生性瘢痕来自烧伤愈后、瘢痕增生半年之患者手术切除标本。分为甲、乙、丙、丁、戊、己六种浓度组及空白对照组庚组。脂质体包裹核酶转染实验组培养细胞,测定培养上清羟脯氨酸含量、反转录多聚链反应法测量细胞内Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA含量。结果:①细胞上清羟脯氨酸含量:甲-已组明显低于庚组(2.33±0.04,2.32±0.04,2.42±0.04,2.41±0.05,2.20±0.03,2.12±0.04,2.85±0.07)μg/L,P<0.01。②I型胶原mRNA表达甲-已组明显低于庚组:(0.796±0.034,0.834±0.017,0.860±0.026,0.838±0.023,0.842±0.031,0.858±0.037,0.940±0.037)μg/L,P<0.05。③Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达:甲-已组明显低于庚组:(1.496±0.039,1.668±0.052,1.154±0.093,1.078±0.093,1.270±0.060,1.182±0.111,2.001±0.099)μg/L。④应用核酶前后瘢痕体积变化:A组、G组、H组实验前明显高于实验后[(28.31±2.10,25.60±1.20)(33.65±1.76,32.71±3.92)(29.53±2.50,28.80±2.71)mm3]。结论:所合成及扩增、转染的核酶可抑制人瘢痕成纤维细胞合成胶原,并能有效减少人增生性瘢痕裸鼠动物模型中瘢痕的胶原含量。
- 朱斌朱家源张涛唐冰李新强陈东张伟李爽
- 关键词：瘢痕成纤维细胞胶原核酶
- Ⅰ、Ⅲ型前胶原核酶治疗裸鼠增生性瘢痕后胶原形态的改变被引量：1
- 2005年
- 目的:研究Ⅰ、Ⅲ型前胶原核酶治疗裸鼠增生性瘢痕后胶原含量及分布的改变。方法:①建立裸鼠增生性瘢痕动物模型(80只)。②将裸鼠随机分为:实验组(A组20只,注射Ⅰ型前胶原核酶;B组20只,注射Ⅲ型前胶原核酶;C组20只,注射Ⅰ型及Ⅲ型前胶原核酶;各组又分为2. 5μg/100μL及5. 0μg/μL两个剂量组,每个剂量组各10只裸鼠,每天用微量注射器行瘢痕内多位点注射1次,共7d)及对照组(D组10只,注射生理盐水7d;E组10只,空白对照组)。③应用苦味酸天狼猩红染色偏振光法,结合图像分析技术,观察分析各组胶原含量及分布的改变。结果:A组Ⅰ型胶原由紧密排列,变成较稀疏,提示含量减少;B组Ⅲ型胶原在血管旁及Ⅰ型胶原间分布减少;C组Ⅰ、Ⅲ型胶原均减少;D组和E组无明显变化。结论:Ⅰ、Ⅲ型前胶原核酶治疗裸鼠增生性瘢痕后,可使胶原的排列分布稀疏,含量减少,形态改变明显。
- 张涛朱家源朱斌李新强唐冰
- 关键词：核酶增生性瘢痕天狼猩红胶原
- Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究被引量：3
- 2004年
- 目的体外研究锤头型α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件.同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响.方法将含α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ),经体外32p标记转录后形成产物靶RNA.同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-g Ⅰ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录,产物(核酶)与各自的32P-靶RNA按不同的条件混和反应,电泳后放射自显影观察结果.将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内,采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响.结果两种核酶在37℃、42℃均能有效切割各自的靶RNA,对Mg2+浓度的要求范围较宽(10～20mmol/L);反应温度从65℃逐渐降至并维持在37℃的条件下核酶切割活性显著提高.Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低,胶原蛋白生成降低,胶原生成明显受抑制.结论针对α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成.
- 朱家源朱斌徐兵张涛陈东唐兵李新强
- 关键词：前胶原基因核酶体外活性成纤维细胞瘢痕
- 苦味酸-天狼猩红偏振光法对瘢痕动物模型的鉴定(英文)被引量：8
- 2006年
- 背景:在瘢痕研究中急需稳定可靠的实验动物模型。目的:运用组织学方法对裸鼠瘢痕动物模型进行鉴定,确定最佳使用时机。设计:随机对照的重复测量设计。单位:中山大学附属第一医院烧伤科。材料:实验于2004-01/03在中山大学医学院动物实验中心完成。15只4～6周龄裸鼠(性别随机,体质量15～25g)由中山大学医学院实验动物中心提供;增生性瘢痕来自烧伤愈后、瘢痕增生半年之患者手术切除标本。方法:于裸鼠背侧移植人增生性瘢痕,建立疤痕动物模型;移植后4周起,每周处死5只实验动物,取移植物,100g/L甲醛固定标本,持续3周。苦味酸-天狼猩红染色偏振光检测移植物及临床取材,观察组织特点。主要观察指标:①苦味酸-天狼猩红染色偏振光法读片结果。②计算机图像分析结果。结果:①苦味酸-天狼猩红染色偏振光法读片结果:各时段组移植物在偏振光下呈现相同的以黄、红粗大纤维为主、疏网状绿色纤细纤维散在分布的特点。②计算机图像分析结果:临床病理性增生性瘢痕中,Ⅰ型胶原约占74%,Ⅲ型胶原约占26%;4～6周移植物中,Ⅰ型胶原含量分别为(74.52±0.47)%,(74.43±0.53)%,(74.69±0.63)%;Ⅲ型胶原分别约为(25.48±0.47)%,(25.57±0.53)%,(25.31±0.63)%,差异不显著(P>0.05)。结论:在实验所设计时段中,移植物与临床取材特性一致,符合增生性瘢痕特点。苦味酸-天狼猩红染色偏振光检测瘢痕组织胶原是对增生性瘢痕组织测定的简便、有效手段;运用裸鼠建立瘢痕动物模型是行之有效的、稳定的。
- 朱斌朱家源张涛唐冰李新强郑树森陈东张伟李爽
- 关键词：增生瘢痕
- 针对α_1 Ⅰ型及α_1 Ⅲ型前胶原基因第二外显子片段核酶的构建被引量：4
- 2004年
- 目的 构建出针对α1Ⅰ型及α1Ⅲ型前胶原基因第 2外显子 (Exon 2 )片段的核酶。方法 根据α1Ⅰ型及α1Ⅲ型前胶原基因的碱基序列以及锤头型核酶 (ribozyme)的结构域要求 ,利用聚合酶链反应 (PCR)分别构建了针对各自的Exon 2区域的核酶基因 ,并克隆到T载体 (pGEM Tvector)T7启动子下游。结果 分别以引物对PⅠL/PⅠR及PⅢL/PⅢR进行PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳各得到约6 2bp的DNA片段 ,与预期的核酶基因大小一致。结论 经PCR限制性内切酶酶切及序列测定分析 ,证实为所设计的插入正确的核酶基因 ,从而为大量制备核酶及其体外切割实验和胞内与mRNA相互作用的研究打下了基础。
- 朱家源朱斌徐兵张涛陈东苏爱云郭浩光唐斌
- 关键词：第二外显子核酶聚合酶链反应
