国家自然科学基金(81171776)
- 作品数：12 被引量：39H指数：5
- 相关作者：王义生李月白赵国强李劲峰王亚寒更多>>
- 相关机构：郑州大学第一附属医院郑州大学生物化学与分子生物学教研室更多>>
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- 双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响被引量：7
- 2017年
- 目的观察双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响。方法取第3代兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），随机分为6组：（1）正常组：正常BMSCs，无特殊处理。以下5组均给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇。（2）模型组：无基因转染BMSCs；（3）无关序列组：10 μl无关序列载体转染BMSCs；（4）干扰过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达组（siPPARγ组）：10 μl siPPARγ基因载体转染BMSCs；（5）exCGRP组：10 μl降钙素基因相关肽（CGRP）基因载体转染BMSCs；（6）双基因组：10 μl双基因重组载体转染BMSCs。实验第7、14天检测各组细胞中PPARγ、CGRP、Runt相关基因2（Runx2）、骨钙素mRNA与其蛋白表达。结果实验第7天，双基因组、siPPARγ组、正常组中PPARγ mRNA与蛋白均呈低表达（0.329±0.037与0.162±0.013、0.413±0.045与0.174±0.023、0.376±0.042与0.169±0.021），明显低于模型组（0.672±0.079与0.871±0.096）、无关序列组（0.674±0.083与0.823±0.089）、exCGRP组（0.683±0.079与0.839±0.091），差异均有统计学意义（均P＝0.000）。双基因组、exCGRP组中均明显表达CGRP mRNA与蛋白，显著高于模型组、无关序列组、siPPARγ组、正常组，差异均有统计学意义（均P＝0.000）。双基因组、exCGRP组、siPPARγ组、正常组中Runx2 mRNA、骨钙素mRNA与蛋白均呈高表达，双基因组显著高于模型组、无关序列组，且明显高于exCGRP组、siPPARγ组、正常组，差异均有统计学意义（均P＝0.000）。实验第14天，各组表达量与第7天一致。结论双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞，能够同时高效阻止细胞中成脂基因表达并上调成骨基因表达，显著优于单一基因的作用。
- 吕本浩李劲峰马源李成尚国伟李月白王义生
- 关键词：转染乙醇干细胞基因表达
- 双基因重组载体对乙醇作用下兔干细胞增殖与成骨活性的影响被引量：2
- 2018年
- 目的 观察双基因重组载体对乙醇作用下兔干细胞增殖与成骨活性的影响.方法 取第3代兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）,随机分为6组：（1）正常组：正常培养BMSCs,无基因转染;（2）模型组：无基因转染BMSCs;（3）无关序列组：10μl无关序列载体转染BMSCs;（4）沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ （siPPARγ）组：10μl siPPARγ基因载体转染BMSCs;（5）表达降钙素基因相关肽（exCGRP）组：10μl CGRP基因载体转染BMSCs;（6）双基因组：10μl双基因重组载体转染BMSCs.除正常组外,其余各组细胞给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇.采用噻唑蓝（MTT）法检测BMSCs增殖,第14天检测各组细胞内碱性磷酸酶活性、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、培养基中骨钙素含量,并作碱性磷酸酶（ALP）染色.结果 双基因组细胞增殖明显,增殖曲线接近于正常组.细胞中ALP活性、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、培养基中骨钙素含量：双基因组数值最高,分别为（18.593±2.350） U/L、（24.422 ±3.110） ng/ml、（5.951 ±0.650） μg/L、（5.836 ±0.630） ng/ml,显著高于模型组[（6.528 ±0.830） U/L、（9.422±1.250） ng/ml、（1.733±0.230） μg/L、（2.016 ±0.240） ng/ml]、无关序列组[（7.011±0.850） U/L、（9.693±1.260） ng/ml、（1.663 ±0.220） μg/L、（1.913±0.230） ng/ml],明显高于siPPARγ组[（13.536 ±1.710） U/L、（17.103±2.230） ng/ml、（3.486±0.410） μg/L、（3.686±0.420） ng/ml]、exCGRP组[（13.692 ±1.760） U/L、（17.185 ±2.240） ng/ml、（3.525±0.420） μg/L、（3.833±0.430） ng/ml]、正常组[（15.056±1.910） U/L、（18.528±2.430） ng/ml、（4.035±0.460）μg/L、（4.012±0.460） ng/ml],差异均有统计学意义（均P=0.000）.模型组、无关序列组数值显著低于正常组,差异均有统计学意义（均P=0.000）.siPPARγ组、exCGRP组数值略低于正常组,差异均无统计学意义：ALP活性（P=0.222、0.274）,层粘连蛋白（P =0.
- 刘柯希李劲峰李月白王义生
- 关键词：乙醇干细胞增殖成骨活性
- 沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ表达降钙素基因相关肽基因重组载体的构建与鉴定被引量：5
- 2014年
- 目的 构建与鉴定沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ（PPARγ）同时表达降钙素基因相关肽（CGRP）基因重组载体.方法 选用pGFP-V-RS载体,将PPARγ小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸靶序列连接入pGFP-V-RS载体,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ;将CGRP片段与Mlu Ⅰ酶切,并与末端羟基化的线性质粒pGFP-V-RS重组连接,得到重组载体pGFP-V-RS-exCGRP.将获取的CGRP基因片段连接入线性化重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP.收集第3代HEK-293细胞,将细胞分为4组：CON组：转染空载体pGFP-V-RS质粒,作为对照；SI组：转染重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ质粒；EX组：转染重组pGFP-V-RS-exCGRP质粒；DOU组：转染重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP质粒.每组电极杯中加入5x106个细胞,并分别加入上述质粒2.5μl,给予直流电低压脉冲1次,时间15 ms.培养48 h后收集各组细胞,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）与Western blot检测细胞内PPAR、CGRP mRNA及蛋白的表达.结果 重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP经酶切鉴定及测序结果与设计完全一致.电转染HEK-293细胞后,DOU组细胞PPARγ基因呈低表达,PPARγmRNA与其蛋白的相对表达量为0.036±0.003、0.108 ±0.031,与EX组（0.156±0.014、0.778±0.103）及CON组（0.148±0.014、0.742 ±0.143）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,与SI组（0.054±0.005、0.135 ±0.039）比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.DOU组细胞CGRP基因呈高表达,CGRP mRNA与其蛋白的相对表达量为1.144±0.106、1.244±0.184,与SI组（0.320±0.030、0.370±0.089）及CON组（0.444 ±0.041、0.274±0.062）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,与EX组（1.021 ±0.095、1.221±0.181）比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 成功构建出沉默PPARγ基因并表达CGRP基因的重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP,能够有效阻断PPARγ基因表达,同时促
- 王义生李宁博李劲峰施佳辰孙俊魁李月白赵国强
- 关键词：RNA干扰降钙素基因相关肽
- 激素对人骨髓间充质干细胞神经肽受体mRNA表达的影响被引量：5
- 2012年
- 目的观察激素对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）内神经肽受体降钙素基因相关肽受体（CGRPR）、P物质受体（SPR）及过氧化物酶体增殖子活化受体1（PPA脚）、成骨转录因子Runx2等基因表达的影响。方法密度梯度离心联合贴壁分选法体外分离培养hBMSCs，流式细胞仪鉴定后传至第3代，随机分为两组，实验组细胞给予1×10^-7mol／L地塞米松干预9d，对照组正常培养。观察细胞形态、生长趋势，油红O染色脂肪细胞，实时定量-聚合酶链反应（RT—qPCR）分析mRNA表达的变化。结果分离培养的贴壁细胞呈纤维状、漩涡样生长，CD29、CD44表达率为（91．4±0．7）％、（93．8±0．5）％，CD34表达率为（2．7±0．8）％。实验组细胞生长缓慢、出现大量脂肪细胞，对照组细胞增殖旺盛、未见脂肪细胞。RT—qPCR发现实验组CGRPRmRNA、SPRmRNA、Runx2mRNA的表达显著降低，2△△^Cr分别为0．10±0．03、0．16±0．04、0．23±0．05（P均〈0．01）。实验组PPARlmRNA表达量2△△^Cr是对照组的（5．08±3．37）倍，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论激素能够诱导hBMSCs成脂分化，下调细胞中CGRPRmRNA、SPRmRNA、Runx2mRNA表达，抑制细胞成骨分化与生长增殖，使骨修复能力不足，这可能与激素性骨坏死的发生机制有关。
- 王义生张战峰李月白赵国强朱绍阳
- 关键词：骨髓间充质干细胞激素神经肽P物质受体
- 晚期乙醇性股骨头坏死骨组织中相关基因的表达被引量：5
- 2014年
- 目的 观察晚期乙醇性股骨头坏死（ONFH）坏死区骨组织细胞中相关基因的表达.方法 收集在全髋关节置换术中切除的20个股骨头,其中,10例世界骨循环研究学会（ARCO）分期Ⅲ-C、Ⅳ期乙醇性ONFH,作为实验组;10例GardenⅢ、Ⅳ型新鲜股骨颈骨折的股骨头,作为对照组.采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）分别测定两组坏死骨组织细胞中骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、成骨转录因子-2（Runx-2）、过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPAR-y）、护骨素（OPG）、破骨细胞分化因子（RANKL） mRNA的表达.结果 实验组细胞中BMP-2、Runx-2、PPAR-γ、OPG、RANKL mRNA表达水平均较对照组明显降低,2-△△Ct值分别为0.51 ±0.04、0.46 ±0.09、0.59±0.07、0.31 ±0.04、0.52±0.06,两组间差异均有统计学意义（P＜0.01）.结论 晚期（ARCOⅢ-C、Ⅳ期）乙醇性ONFH的骨组织坏死区很大,股骨头内残存的骨活性成分和细胞很少,其成骨与成脂基因表达均降低,股骨头已毁损,适于行人工髋关节置换术.
- 李明王义生王宸李宁博赵国强李月白
- 关键词：乙醇股骨头坏死晚期基因
- 乙醇对人骨髓间充质干细胞神经肽及凋亡相关基因表达的影响被引量：3
- 2013年
- 目的观察在乙醇作用下人骨髓问充质干细胞（hBMSCs）中神经肽受体及凋亡相关基因mRNA表达的变化。方法密度梯度离心贴壁培养获得hBMSCs，流式细胞仪鉴定后传至第3代，随机分为实验组及对照组，实验组加入浓度为0．09mol／L乙醇，对照组正常培养。培养11d后，采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT—qPCR）分析两组中过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPAR．1）、降钙素基因相关肽受体（CGRPR）、成骨转录因子（Runx2）及凋亡相关基因B淋巴细胞／白血病-2（bcl-2）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase．3）mRNA的表达。结果实验组CGRPR、Runx2、bcl-2mRNA表达较对照组降低，CGRPR（1．90E-01±4．12E-02比3．27E-01±8．24E-02，t=6．66，P〈0．05）、Runx2（1．28E-01±3．18E-02比2．50E-01±5．33E-02，t=8．80．P〈0．05）、bcl-2（1．65E-01±3．98E-02比2．95E-01±6．78E-02，t=7．35，P〈0．05）．Caspase-3mRNA与PPAR-1mRNA表达较对照组增高，Caspase．3（5．27E-01±1．26E-01比3．17E-01±7．46E-02，t=6．39。P〈0．05）、PPAR-γ（2．90E-01±、6．74E-02比1．15E-OI±3．36E-02，t=10．38，P〈0．05），差异有统计学意义。结论乙醇能够上调hBMSCs中凋亡基因、成脂基因表达，下调神经肽因子、抗凋亡基因、成骨基因表达，导致细胞凋亡、成脂分化，抑制成骨分化。
- 荆凯王义生左松李辰成李月白
- 关键词：骨髓间充质干细胞乙醇B淋巴细胞白血病-2
- 激素对人骨髓间充质干细胞凋亡及神经肽受体基因表达的影响被引量：6
- 2013年
- 目的观察在激素诱导下，人骨髓问充质干细胞（hBMSCs）内降钙素基因相关肽受体（CGRPR）、P物质受体（SPR）、过氧化物酶体增殖子活化受体吖（PPARy）、成骨转录因子Runx2以及B淋巴细胞／白血病-2（bcl．2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等基因表达的变化。方法密度梯度离心和贴壁培养获得hBMSCs，流式细胞仪鉴定后，将传代培养的第3代细胞随机分为两组，实验组加入浓度为1×10^-7 mmol／L的地塞米松，对照组正常培养。于诱导后的第7天，实时定量-聚合酶链反应（RT．qPCR）分别测定bcl-2mRNA、Caspase-3mRNA、CGRPRmRNA、SPRmRNA、Runx2mRNA以及PPARymRNA的表达。结果分离培养的hBMSCs呈均匀-致的长梭形，排列成旋涡状或放射状。实验组Caspase-3mRNA、PPA聊mRNA较对照组明显升高，^2-△△C1值分别为5．99±2．00、6．93±0．70；而bcl-2tuRNA、CGRPRmRNA、SPRmRNA、Runx2mRNA较对照组明显降低，2^-△△C1值分别为0．20±0．5l、o．Il-t-O．02、0．28±0．08、0．13±0．2l，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论激素能够上调hBMSCs中凋亡基因、成脂基因表达，下调抗凋亡基因、神经肽因子、成骨基因表达，促进细胞凋亡、成脂分化，抑制其成骨分化。
- 王义生左松荆凯张毅李月白
- 关键词：人骨髓间充质干细胞激素神经肽脱噬作用
- 重组人降钙素基因相关肽逆转录病毒对人骨髓间充质干细胞增殖与成骨活性的影响被引量：5
- 2013年
- 目的 将重组人降钙素基因相关肽α（hCGRPα）逆转录病毒载体（pLNCX2-hCGRPα）感染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）,观察其对hBMSCs增殖与成骨活性的影响.方法 采用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心法获得自体原代hBMSCs并传代保存.将重组逆转录病毒pLNCX2-hCGRPα感染第2代hBMSCs.细胞分3组：（1）实验组：pLNCX2-hCGRPα感染hBMSCs.（2）空载体组：空载体pLNCX2感染hBMSCs；（3）正常对照组：正常培养hBMSCs,不给予特殊处理.实验7d采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法检测细胞内hCGRPα基因mRNA与蛋白表达,1 ～7d采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性,14 d检测细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性值与培养液骨钙素含量,7d检测细胞层粘连蛋白（LN）.结果 实验组细胞中表达hCGRPα mRNA,而空载体组和正常对照组细胞不表达.与空载体组和正常对照组比较,实验组细胞表现出较高增殖率（P＜0.05）.实验组细胞ALP活性值、LN、培养液骨钙素含量分别为（119.33±11.95） U/100 mg蛋白、（12.11±1.56） μg/L、（1.123 ±0.115） μg/L,均高于空载体组[（66.16±6.82） U/100 mg蛋白、（7.32±0.98）μg/L、（0.602 ±0.097） μg/L和正常对照组[（67.73±7.31） U/100 mg蛋白、（6.46±1.41） μg/L、（0.498±0.109） μg/L],差异均有统计学意义（P＜0.05）,而空载体组和正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 重组hCGRPα逆转录病毒成功转入hBMSCs,并表达hCGRPα基因而促进hBMSCs增殖和增强细胞的成骨活性.
- 王义生王宸王亚寒孙俊魁李劲峰赵国强李月白
- 关键词：重组逆转录病毒降钙素基因相关肽骨髓间充质干细胞成骨活性
- 激素性股骨头坏死晚期患者中相关基因表达被引量：1
- 2015年
- 目的 观察激素性股骨头坏死（ONFH）晚期患者坏死区骨组织中相关基因的表达.方法 收集手术切除的20个股骨头,其中,10例晚期激素性ONFH作为实验组,10例头下型股骨颈骨折作为对照组.采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）分别测定两组坏死骨组织中骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、过氧化物酶体增殖子活化受体γ（PPARγ）、护骨素（OPG）、成骨转录因子（Runx2）及核因子（NF）-κB受体活化因子配基（RANKL） mRNA的表达水平.结果 实验组坏死骨组织中BMP-2、PPARγ、OPG、Runx-2及RANKL mRNA水平均较对照组明显下调,2-△△Ct分别为0.38±0.05、0.47 ±0.05、0.44±0.06、0.37 ±0.05、0.43 ±0.05,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 晚期激素性ONFH坏死区面积大,其内残存骨活性成分很少,其成骨与成脂基因表达均下调,股骨头已毁损而不可能再生,应施以全髋关节置换术.
- 张弛王义生李宁博王宸赵国强李月白
- 关键词：股骨头坏死激素全髋关节置换术基因
- 神经肽基因转染干细胞联合自体骨移植治疗兔股骨头坏死被引量：4
- 2017年
- 目的探讨降钙素基因相关肽转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）联合自体骨移植治疗模型兔股骨头坏死（ONFH）的组织病理学改变。方法采用骨内液氮冷冻法成功制作出家兔ONFH动物模型。将48只ONFH模型动物随机分为3组：A组：人降钙素基因相关肽α（hCGRPα）基因转染BMSCs组：将hCGRPα基因转染BMSCs联合自体骨移植于股骨头内；B组：空质粒组：植入干细胞为空质粒BMSCs联合自体骨移植；C组：无关序列组：植入干细胞为无关基因BMSCs联合自体骨移植。于实验第3、6个月末分批处死兔，观察兔股骨头的组织病理学变化。结果实验3个月时，A、B、C组正常侧股骨头中，骨小梁面积分数分别为（40.89±1.12）%、（36.12±1.17）%、（36.33±1.53）%、（42.11±1.91）%，空骨陷窝计数分别为（11.34±1.58）%、（16.33±1.45）%、（17.21±1.23）%、（10.47±1.41）%。A组中股骨头内有大量骨细胞增殖生长，骨小梁较成熟，骨小梁面积分数高，空骨陷窝少，接近于正常侧，明显优于B、C组。而B、C组中骨小梁细小、不规则，骨小梁面积分数低，空骨陷窝多，骨修复不完整。6个月时，A组中骨小梁成熟，致密饱满，排列规则整齐，骨小梁面积分数与空骨陷窝计数均仍优于B、C组。结论hCGRPα转基因BMSCs联合自体骨移植入动物模型股骨头中，能够显著促进细胞增殖，加速成骨，增强骨组织修复，获得治疗ONFH的良好效果。
- 王义生段家晨李劲峰王亚寒王秀利刘鸣李月白
- 关键词：降钙素基因相关肽骨髓间充质干细胞股骨头坏死
