国家自然科学基金(31072236)
- 作品数：8 被引量：3H指数：1
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- 对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白Vp28基因的克隆、表达及蛋白纯化
- 2011年
- 以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶(SmaⅠ,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体.转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52 kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24 h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白.
- 吴小婷陈曦陈宇刘斌吴文林
- 关键词：对虾白斑综合症病毒VP28纯化
- 凡纳滨对虾铁蛋白基因的克隆与表达被引量：1
- 2011年
- 以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白(Ferritin)基因,经特定的酶切(Not1,Sma1)后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌.经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体.再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础.
- 吴文林傅玲玲陈宇陈曦
- 关键词：凡纳滨对虾铁蛋白
- RR基因沉默对WSSV病毒复制的影响
- 2014年
- 对虾白斑综合症病毒(WSSV)编码与核酸合成代谢相关的核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide Reductases,RR),与病毒DNA的复制有关.利用克隆技术将RR基因克隆到L4440载体,构建体内合成dsRNA的大肠杆菌HT115工程菌.诱导该工程菌合成了RR基因的特异双链RNA(RR-dsRNA)和非特异双链RNA(gfp-dsRNA),分别与WSSV混合共注射凡纳滨对虾,在感染72h后用病毒检测试剂盒提取DNA模板用于荧光定量PCR分析,结果显示RR-dsRNA能有效抑制WSSV病毒粒子的增值.
- 陈朝阳史鑫娜郑丽燕吴文林
- 关键词：双链RNAWSSV
- 人Rab7基因的原核表达与多克隆抗体制备被引量：1
- 2014年
- 利用RT-PCR技术从HEK293细胞中克隆到人Rab7基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞,获得阳性克隆.24℃下IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得高纯度的Rab7蛋白.并以此为抗原免疫小白鼠,获得了Rab7的特异性抗体.
- 吴冰艳肖惠吴文林
- 关键词：原核表达抗体
- 南美白对虾TCTP基因表达分析
- 2013年
- 以β-actin为内参基因,通过荧光PCR方法,分析了翻译调控肿瘤蛋白(TCTP)基因在南美白对虾不同组织中的表达情况,结果表明,TCTP基因在对虾的各种组织中均有表达,但在肌肉中表达量最高,而心脏中的表达最低.
- 黄华根沈文英吴文林
- 关键词：南美白对虾TCTP
- 人超氧化物歧化酶(SOD)基因的原核表达与蛋白纯化
- 2011年
- 从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶(BamHⅠ,SmaⅠ)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体.转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44 kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha-rose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白.
- 吴文林陈宇吴小婷
- 关键词：超氧化物歧化酶基因重组纯化
- 对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化
- 2012年
- 采用PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因,插入到pGEX-4T-2表达载体上构建出带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-2RR,然后将重组质粒转化大肠杆菌.转化菌经IPTG诱导后大量表达重组蛋白,通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白.
- 吴文林杨培峰陈宇陈曦
- 关键词：对虾白斑综合症病毒纯化
- 响应面优化多细胞因子联合诱导分离树突状细胞的工艺被引量：1
- 2017年
- 目的优化多细胞因子联合诱导分离树突状细胞(DC)工艺,提高小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)体外诱导分离效率。方法采用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)、脂多糖(LPS)、重组小鼠肿瘤坏死因子α(rmTNF-α)和诱导时间为考察因素,未成熟树突状细胞(imDC)和成熟树突状细胞(mDC)获得量为考察指标,采用Box-Behnken设计试验,响应面法分析并验证试验结果,并结合光学显微镜、电子显微镜、流式细胞术分析BMDC形态、表面标志物等指标。结果响应面优化诱导imDC最佳诱导工艺rmGM-CSF为46 ng/mL、rmIL-4为24 ng/mL,诱导时间为6 d;imDC获取量为(4.58±0.28)×10~6个,相对偏差为4.00%。诱导mDC最佳工艺LPS为1.4μg/m L、rmTNF-α为30 ng/m L,诱导时间为1 d;m DC获取量为(4.21±0.15)×10~6个,相对偏差为3.80%。体外诱导5~7 d,可获得足量的具有典型树突状的DC,流式细胞术检测发现imDC较高表达CD11c(68.62%±2.3%),低表达CD86(37.95%±1.8%);mDC高表达CD11c(82.05%±1.6%)和CD86(90.34%±1.4%)。结论单因素实验与响应面优化联合优化多细胞因子体外快速、高效诱导扩增DC,为进一步研究提供了工具。
- 段训威肖桂清赵艳兰王礼兴郑晨娜董乐吴文林
- 关键词：未成熟树突状细胞成熟树突状细胞BOX-BEHNKEN设计
