国家高技术研究发展计划(2006AA02Z443)
- 作品数：3 被引量：12H指数：2
- 相关作者：邹全明毛旭虎程琰余抒张卫军更多>>
- 相关机构：第三军医大学江苏省疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划重庆市科技攻关计划重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性被引量：3
- 2008年
- 目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。
- 程琰罗萍张卫军顾江邹全明毛旭虎
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7融合蛋白免疫学活性
- 致病性大肠杆菌引发宿主细胞A／E损伤分析方法的建立被引量：2
- 2009年
- 目的建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段。方法以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型。采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC O157∶H7 Sakai株和弱毒株EHEC O157∶H7 00B015以及E.coliDH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度。结果EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05)。EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05)。结论成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法。
- 王海光顾江余抒张卫军邹全明朱凤才毛旭虎
- 关键词：肠致病性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌
- 原核融合表达载体的设计、构建及应用被引量：7
- 2008年
- 目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白。分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性。结果构建的表达载体pEspA可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白获得高效表达。先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合表达及纯化又提供了一种可供选择的工具。
- 程琰毛旭虎王庆旭余抒刘艳青张晓丽宁亚蕾邹全明
- 关键词：融合表达载体肠出血性大肠杆菌O157:H7
