国家自然科学基金(31070006)
- 作品数：15 被引量：72H指数：5
- 相关作者：夏立秋丁学知胡胜标孙运军杨燕更多>>
- 相关机构：湖南师范大学湖南科技大学益阳广播电视大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响被引量：3
- 2016年
- 【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。
- 杨燕罗林根徐妙夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌阻断多杀菌素
- 粘细菌Myxococcus macrosporus STXZ54抗肿瘤活性物质的分离制备及其活性测定被引量：3
- 2014年
- 粘细菌作为第三大类次级代谢产物产生菌,是挖掘抗肿瘤新药物的重要资源。将本实验室保藏的粘细菌菌株Myxococcus macrosporus STXZ54进行发酵培养后,通过对发酵液进行硫酸铵沉淀、丙酮沉淀等,分析了该菌株发酵液中抗肿瘤活性物质的性质,采用高效液相色谱技术对发酵液中的抗肿瘤活性物质进行了分离,并对该物质进行了肿瘤细胞毒性的测定,利用激光共聚焦显微镜观察该物质作用B16后的亚细胞结构变化。实验结果表明该物质可能为常温下性质较稳定的蛋白质类化合物,纯化到的单一组分WGF5对B16,Hela,MCF-7,Hep-3B肿瘤细胞均具有较强的抑制作用,其作用48 h的IC_(50)(最低半抑制浓度)分别为2.767μg/ml、2.204μg/ml、3.758μg/ml、3.073μg/ml。MTT实验以及激光共聚焦显微镜下观察分析发现,蛋白WGF5能够明显改变细胞形态并最终导致肿瘤细胞死亡。从粘细菌Myxococcus macrosporus STXZ54分离到的活性物质具有广谱高效的抗肿瘤效果,有开发成抗肿瘤新药物的潜在价值。
- 文也唐少军肖蓉丁学知黄同龙雷良欢夏立秋
- 关键词：粘细菌抗肿瘤色谱分离激光共聚焦显微镜
- 一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究被引量：1
- 2014年
- 以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象,通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定,该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,命名为HX08,并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库,获得登陆号KF774302.通过生测发现,HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究,建立了HPLC技术分离体系,使用H2O做流动相,以0.5 mL/min流速洗脱,检测波长分别为215、254和280 nm,收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDS-PAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解,利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析,鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.
- 刘慰秦浩刘霜刘雪梅孙运军丁学知夏立秋
- 关键词：枯草芽胞杆菌菌株鉴定生理生化特性杀虫活性
- 粘细菌新菌株的分离纯化及其抗肿瘤活性研究
- 粘细菌(myxobacteria)是一类好氧的革兰阴性菌,分类上属于变形杆菌(Proteus)的Delta分支。粘细菌因其具有复杂的多细胞聚集行为特性,且能产生丰富的次级代谢产物而受到广泛关注,在农业、医药、生态环境等方...
- 文也
- 关键词：粘细菌次级代谢产物抗肿瘤活性高效液相色谱
- 文献传递
- 大肠杆菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达与抗肿瘤活性被引量：1
- 2014年
- 【目的】从大肠杆菌Nissle1917中获得L-天冬酰胺酶Ⅱ基因,并研究其抗肿瘤活性。【方法】以大肠杆菌Nissle1917基因组为模板PCR扩增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因,克隆至可诱导表达载体pET28a上。将L-天冬酰胺酶Ⅱ表达载体pET28a-asp转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱-质谱(LC-MS)对表达的L-天冬酰胺酶Ⅱ进行鉴定,并通过镍柱亲和层析纯化收集表达出的L-天冬酰胺酶Ⅱ。用纯化定量以后的L-天冬酰胺酶Ⅱ作用小鼠乳腺癌4T1细胞、人肝癌Hep-3B细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC。【结果】来自于大肠杆菌Nissle1917的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因可在大肠杆菌BL21中高效表达并通过LC-MS得到鉴定,细胞毒性实验结果表明L-天冬酰胺酶Ⅱ对4T1细胞和Hep-3B细胞的生长具有较强的抑制作用,而对人脐静脉内皮细胞HUVEC的生长无明显抑制效果。【结论】来源于大肠杆菌Nissle1917的L-天冬酰胺酶Ⅱ能显著抑制4T1细胞和Hep-3肿瘤细胞的生长,而对人正常组织细胞的生长无明显抑制效果,为进一步研究L-天冬酰胺酶Ⅱ特异性抗肿瘤作用机制和对实体瘤的应用研究奠定了重要基础。
- 梁毅偈孙运军胡胜标颜富张旭白利明张友明丁学知夏立秋
- 关键词：大肠杆菌克隆抗肿瘤
- 通过两种糖多孢菌属菌株原生质体融合提高多杀菌素产量研究被引量：5
- 2019年
- 多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌产生的一种新型绿色环保杀虫剂,兼具化学农药的高效性与生物农药的安全性。本研究通过将红色糖多孢菌和刺糖多孢菌两种菌株做原生质体融合探究来得到高产多杀菌素的菌株。首先构建了不产红霉素的红色糖多孢菌工程菌株,然后将其与刺糖多孢菌做原生质体融合,经加有抗生素平板培养基及发酵液HPLC分析筛选,得到了产多杀菌素的4株融合菌株。基于4株融合菌株多杀菌素产量都不及起始菌株高,接着采用不加抗生素直接筛选的方法,成功筛选到若干高产多杀菌素的融合菌株,其中菌株B-2多杀菌素产量提高最为明显,较原始菌株增加了331%,并用质谱分析做了进一步的验证。融合菌株B-2后续传代培养多杀菌素产量稳定,表明遗传稳定性较好。本文对红色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生质体融合进行了探究并且成功提高了多杀菌素的产量,这为具有优良发酵特性的红色糖多孢菌和刺糖多孢菌融合菌株的构建提供了重要基础。
- 易卓夏立秋丁学知胡胜标罗玉双王海龙唐滢黄鑫
- 关键词：多杀菌素生物农药原生质体融合质谱分析
- 丁烯基多杀菌素高产菌株的巴龙霉素抗性筛选被引量：10
- 2015年
- 为了提高须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的丁烯基多杀菌素产量水平,利用核糖体工程技术,对其进行巴龙霉素抗性筛选,在10×MIC巴龙霉素浓度下,分离得到巴龙霉素自发抗性突变株54株。通过对原始菌株和突变株代谢产物变化的初步研究发现,相比于原始菌株,丁烯基多杀菌素组分在抗性突变株中的合成能力有明显差异,有6株抗性突变株的产量明显高于原始菌株,约20%左右的突变株产量提高,约45%左右的突变株产量降低。其中突变株P-7的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍。对巴龙霉素抗性突变株P-7进行DNA序列分析,在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中发现点突变,第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸。
- 邬洋徐妙罗林根杨燕夏立秋
- 关键词：巴龙霉素RPSL基因
- 环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响被引量：5
- 2014年
- 【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S.spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S.spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S.spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S.spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S.spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S.spinosa-1。扫描电�
- 徐妙邬洋杨燕夏立秋
- 关键词：刺糖多孢菌多杀菌素RED
- 利用混料设计优化多杀菌素发酵培养基被引量：3
- 2014年
- 利用Plackett-Burman试验设计从8种营养成分中筛选出4种对多杀菌素产量影响较显著的因子:葡萄糖、棉籽粉、玉米浆、豆饼粉,而后通过D-最优混料设计,对这4种成分进行优化设计。以多杀菌素的产量为期望,进行回归分析并建立关于多杀菌素产量的二阶拟合方程,确定4种成分的最佳比例为:葡萄糖59 g/L、棉籽粉28 g/L、玉米浆6.5g/L、豆饼粉6.5g/L,根据方程预测产量理论最高值为256.75mg/L,按此配方进发酵验证,产量为249.9mg/L,证明该方程的拟合性较好。
- 阎宝清夏立秋龙如花张由恒陈宏
- 关键词：多杀菌素培养基
- 遗传改造刺糖多孢菌构建多杀菌素高产菌株
- 土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）产生的次级代谢产物多杀菌素（Spinosyns）是一种新型大环内酯类天然产物,具有高效生物杀虫活性,是理想的绿色生物杀虫剂。但是野生刺糖多孢菌合成...
- 徐妙
- 关键词：刺糖多孢菌多杀菌素
- 文献传递
