湖南省自然科学基金(09JJ5014)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
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- 相关领域：生物学更多>>
- 果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测被引量：6
- 2011年
- 为了利用果蝇模型研究nulp1蛋白在早期心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出果蝇nulp1基因的部分编码区并插入到pET28a表达载体中.之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3);通过IPTG诱导表达His-nulp1融合蛋白,该融合蛋白采用Ni2+金属螯合层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,利用west-ern blot对抗体进行分析.结果表明获得了高效价的特异性兔抗f-nulp1多克隆抗体.这为进一步研究果蝇心脏发育的分子机制创造了条件.
- 龚琳王跃群袁婺洲莫小阳万永奇江志钢吴秀山李永青
- 关键词：果蝇原核表达多克隆抗体
- 斑马鱼整体原位杂交的技术改良被引量：7
- 2010年
- 斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、基因间相互关系和突变体筛选等方面,是研究斑马鱼发育相关基因功能的重要技术。本文从杂交探针的制备、浓度的选择和洗脱以及胚胎的脱色、蛋白酶K消化、底物显色等方面进行了摸索、改进及简化,获得了背景低、着色清晰、特异性高的实验结果,预示了简单实用、成本低廉的斑马鱼整胚原位杂交技术平台的成功建立。
- 樊竑冶彭忠禄谢华平莫小阳王跃群邓云万永奇李永青吴秀山
- 关键词：整体原位杂交斑马鱼胚胎
- 心脏发育候选基因AHNAKβ的克隆和表达研究
- 2009年
- 心脏发育过程是一个错综复杂的过程,由一系列的基因参与完成。虽然目前已经鉴定出很多与心脏发育相关的基因,但是仍有很多心脏发育相关基因有待鉴定。作者从小鼠心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个心脏发育候选基因AHNAKβ。AHNAKβ位于11q12.2,长1 064 bp,由6个外显子和5个内含子组成,其中开放阅读框(ORF)长450 bp(258～710 nt),编码含有149个氨基酸,蛋白质大小约为16.0 kD。我们构建了原核细胞表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化了GST-AHNAKβ融合蛋白,然后制备了该蛋白的兔免疫血清。利用该抗体进行了小鼠成体组织Western blot以分析该基因的蛋白表达模式。研究结果表明AHNAKβ在小鼠成体子宫、小肠等多种组织表达,在心脏中表达较高,提示它可能在心脏组织中具有某种重要作用。
- 李宁莫小阳邓云万永奇吴秀山李永青
- 关键词：心脏发育克隆
- 人类新基因WDR24的研究初报
- 2009年
- WD40家族是一类结构保守、功能复杂的蛋白。目前很多研究显示该家族成员通过参与MAPK信号途径调控细胞内信号转导而影响细胞的基本生命活动。为了鉴定参与细胞生命活动的新基因,运用同源基因克隆法,通过PCR技术扩增获得一个新的人类基因WDR24,其cDNA全长3 302 bp,2 373 bp长的开放阅读框编码由790个氨基酸残基组成的蛋白质。生物信息学分析表明,WDR24蛋白在进化上高度保守,与其他脊椎动物中的同源蛋白组成了一个功能未知的亚家族。蛋白序列分析显示其中有6个WD40重复序列和1个ERK的停泊位点D-domain。RT-PCR分析表明,该基因在所有被检测的人类胚胎组织中表达。
- 周云雷满贤龚琳吴秀山李永青
- 关键词：基因克隆RT-PCR
- 斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体的制备及检测被引量：2
- 2011年
- Foxp4为Fox基因家族的一员,目前研究发现其与怖、肠、心脏以及中枢神经系统的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。按照巢式PCR原理,经过两次PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Foxp4基因片段,将其克隆入表达载体pGEX4T-1,转化至大肠杆菌BL21中,再通过IPTG进行诱导表达GST-Foxp4融合蛋白。融合蛋白先经谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,再经切胶纯化回收,然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,分别进行Western-blot实验检测抗体效价和特异性。所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Foxp4多克隆抗体,为Foxp4功能的进一步研究奠定了基础。
- 刘华友朱玲李帆王琨江志钢吴秀山李永青
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 人类心脏和肌肉组织特异表达基因Smyd1的表达与抗体制备
- 2009年
- Smyd1基因是人类心脏和肌肉特异表达基因,制备该基因的多克隆抗体可以为进一步深入研究Smyd1在心脏发育过程中与其他因子相互作用提供检测工具.通过PCR方法扩增smyd1基因的编码区片段,并将其克隆至PGEX-4T-1上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,再通过5052法和IPTG法分别诱导表达GST-Smyd1融合蛋白.经比较,5052法诱导的蛋白表达量明显高于IPTG法.采用5052法大量诱导表达,通过割胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot检测抗体活性.结果表明,实验获得了高质量的多克隆抗体.
- 谢岁岁王跃群万永奇邓云莫小阳李发祥李永青吴秀山
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染H9c2细胞系的构建
- 2011年
- 运用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)构建pSUPER.retro-Smyd1真核表达质粒,经鉴定后用脂质体法转染H9c2细胞,通过G418筛选出稳定表达pSUPER.retro-Smyd1的细胞系,最后经Western blot及RT-PCR实验鉴定其干扰效果。经鉴定,通过H9c2细胞系构建的pSUPER.retro-Smyd1干扰细胞系的干扰效果显著。因此,本实验成功构建了Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染的H9c2细胞系,为进一步研究Smyd1基因在心脏发育中的作用奠定了良好的实验基础。
- 李帆廖四芳刘华友鲁建鑫刘宪楚刘明吴秀山李永青
- 关键词：RNAI技术SIRNA稳定转染
- 斑马鱼Lefty1特异性多克隆抗体的制备被引量：7
- 2010年
- Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体,通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因(z-lefty1)的部分编码区,将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒(pGEX/z-Lefty1)转化入BL21大肠杆菌,通过IPTG诱导表达GST-z-Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z-Lefty1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。
- 满贤龚琳王跃群李帆刘华友莫小阳邓云万永奇吴秀山李永青
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 小鼠Lbh抗体的制备和鉴定
- 2010年
- 利用小鼠作为模式动物进一步研究人类Lbh(Limb-bud-and-heart)在心脏发育中的功能。提取正常成年小鼠的心脏总RNA,RT-PCR扩增小鼠Lbh的全长开放阅读框,构建原核表达重组质粒pGEX4T-1-Lbh。转化大肠杆菌BL21后,摇菌培养到OD_(600)为0.5～0.6时,加IPTG诱导融合蛋白的表达。将纯化的GST-Lbh融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。免疫印迹法检测表明该抗体有较好的特异性,可用于该基因结构和功能的研究。
- 谭小华王跃群邓云万永奇莫小阳李永青吴秀山
- 关键词：抗体原核表达
