国家高技术研究发展计划(2006AA02Z221)
- 作品数：4 被引量：7H指数：2
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- 相关机构：四川大学更多>>
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程更多>>
- 脱毛碱性蛋白酶定点突变的初步分析被引量：2
- 2010年
- 来自于Bacillus pumilus菌株BA06的碱性蛋白酶DHAP具有良好的脱毛能力.为了更好地了解DHAP的催化特性和进一步改造使之更加符合制革工艺的要求,根据蛋白质同源建模和嗜冷嗜热酶氨基酸组成的统计分析结果,确定了13个氨基酸位点进行定点突变.通过牛奶平板和对粗酶液在不同温度和热稳定性方面的活性进行了分析.结果发现位于DHAP空间结构上底物结合"口袋"开口处α-螺旋上的氨基酸残基(E220,V223和K244)严重影响酶的活性;位于底物结合口袋袋底的三个保守位点V256L、V257I和V258I在常温(28℃)下保留了较高的活性,同时也影响热稳定性;靠近活性位点D140的V201Y突变体可能直接通过与D140的相互作用,导致活性急剧下降.
- 杨庆军张小伟冯红张义正
- 关键词：脱毛蛋白酶定点突变枯草芽孢杆菌
- 制革用脱毛碱性蛋白酶基因的分子进化
- 2009年
- 皮革的生物制革（脱毛）是解决和改善传统制革工业对环境污染的一个重要转变，也是现代生物技术发展的一个重要领域。生物制革的关键是筛选获得高效的脱毛蛋白酶，但是野生型的蛋白酶往往不能很好地满足现有的制革工艺。为此，我们利用现代基因工程技术对野生型的蛋白酶进行改造，创制更加符合现有制革工艺的碱性蛋白酶。
- 关键词：碱性蛋白酶基因脱毛蛋白酶制革工业分子进化现代生物技术制革工艺
- 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的随机突变被引量：2
- 2010年
- 碱性蛋白酶(DHAP)属于丝氨酸蛋白酶家族(S8A),是由275个氨基酸残基组成的单链多肽,没有二硫键,以Asp32、His64、Ser221作为活性中心.采用易错PCR方法,对短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(GenBank登录号:AY458140)进行随机突变.在大肠杆菌中建立随机突变文库,然后转化枯草芽孢杆菌WB600,构建枯草芽孢杆菌突变文库,筛选出酶活性提高或最适反应温度和pH值有所降低的突变体.通过3轮的随机突变和筛选,获得2个阳性突变体pP43AP-M166和pP43AP-M375.其中pP43AP-M166在不同的温度和pH条件下,与出发菌株相比,酶活都有不同程度提高,特别是当反应温度为50℃、pH为10时,突变蛋白酶酶活性提高1.23倍,表现出很好的热稳定性.测序结果表明,该突变体含有一个氨基酸置换,位于碱性蛋白酶催化三联体活性中心His64旁,与其只有一个氨基酸残基相隔.
- 杨锦冯红万民远焦惠科张晓露张义正
- 关键词：碱性蛋白酶短小芽孢杆菌定向进化易错PCR
- 脱毛碱性蛋白酶(DHAP)的饱和突变被引量：3
- 2015年
- 本实验在同源建模和氨基酸序列比对的基础上,选取脱毛碱性蛋白酶(DHAP)8个氨基酸位点进行饱和突变.通过牛奶平板和96孔板发酵筛选,获得了4个催化特性改良的突变体,测序鉴定为D248F,D248S,M233L和W214K.利用酪蛋白和合成肽(AAPL-pN)作为底物,对这些突变体进行了评价,结果表明D248F、D248S、W214K在常温(28℃)下的酪蛋白水解活性提高;M233L在常温、高温(50℃)的酶活以及热稳定性都有增加.同时,M233L和W214K在25℃和50℃水解AAPL-pN的酶活也分别得到了不同程度的提高.
- 黄蓉冯红
- 关键词：冷适应热稳定性酶活性
