中国博士后科学基金(200538259)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- 重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达
- 2006年
- 目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。
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- 关键词：TBID抗原分泌表达
