国家自然科学基金(30801054)
- 作品数：7 被引量：22H指数：3
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- 表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性被引量：1
- 2014年
- 目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×10^11/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期（均P＜0.05）,表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.
- 周珍文姚淑雯关锐梨周帅谢永强陈吟霜钟华敏黄莲芬杨镒宇龚四堂
- 关键词：中性粒细胞激活蛋白免疫测定
- 幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性被引量：5
- 2010年
- 目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性。方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中,0.5mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性。结果:SDS-PAGE示在约87kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51200,Westernblotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别。结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性。
- 周珍文关锐梨夏慧敏邓秋连谢永强黄勇廖灿龚四堂
- 关键词：尿素酶B免疫活性
- 幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列被引量：1
- 2011年
- 目的:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础。方法:根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析。结果:以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2%,IPTG诱导后,pGEX-4T-1-NAP/BL21在相应分子量(42.8 kD)可见融合蛋白的表达。幽门螺杆菌儿童分离株GZCHl NAP序列已登录GenBank(登录号:GU301881)。结论:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础。
- 周珍文关锐梨夏慧敏付捷邓秋连谢永强黄勇廖灿龚四堂
- 关键词：幽门螺杆菌儿童中性粒细胞激活蛋白克隆
- 革兰阴性杆菌新德里金属β内酰胺酶基因的筛查
- 2013年
- 目的 从耐亚胺培南革兰阴性杆菌中筛查金属β内酰胺酶（MBL）及1型新德里金属蛋白酶（NDM）-1,为NDM-1携带菌感染的治疗及防控提供试验依据.方法 回顾性对广州市妇女儿童医疗中心2010年从7例患者分离的7株耐亚胺培南革兰阴性杆菌进行NDM-1基因筛查,使用亚胺培南-EDTA双协同试验筛查MBL阳性菌株,设计特异性引物PCR扩增NDM-1基因,并将其克隆入pMD-T载体,转化Dh5a,提取重组质粒进行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,并将重组质粒菌进行测序验证.结果 从7株亚胺培南耐药革兰阴性杆菌中筛出2株MBL阳性株,分别为1株鲍曼不动杆菌和1株琼氏不动杆菌,其中MBL阳性琼氏不动杆菌PCR扩增出NDM-1目的产物,将NDM-1成功克隆入pMD-T,双酶切鉴定见目的条带,重组质粒测序验证了其为NDM-1基因,序列同源性分析显示其与已知NDM-1基因序列高度一致（99.9％）,813碱基中仅第468核苷酸G-A突变,其演绎的氨基酸序列与已知NDM-1完全一致,其序列已登录GenBank,登录号为HQ603057.药敏试验显示此琼氏不动杆菌对除氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦外的其他所测试的β内酰胺类抗生素均耐药,但对替加环素、氟喹诺酮、氨基糖苷类敏感.结论 在住院儿童血液中筛查出携带NDM-1琼氏不动杆菌,提示临床试验室应加强亚胺培南耐药革兰阴性杆菌NDM-1基因的筛查,为NDM-1携带菌感染的治疗及防控提供试验依据.
- 周珍文谢永强杨镒宇姚淑雯关锐黎钟华敏周帅龚四堂
- 关键词：革兰氏阴性菌Β内酰胺酶类亚胺培南
- 广州地区幽门螺杆菌儿童分离株空泡毒素基因A的分型被引量：1
- 2013年
- 目的探讨广州地区幽门螺杆菌(Hp)儿童分离株空泡毒素基因A(vacA)基因亚型的分布。方法从胃十二指肠疾病患儿胃黏膜标本中分离培养Hp,PCR法测定vacA的m1、m2、s1、s2基因亚型。结果从儿童胃黏膜标本中成功分离出106株Hp,106株中vacA基因m阳性率为94.34%(100/106),阴性率为5.66%(6/106)。m1阳性率为36.00%(36/100),m2阳性率为64.00%(64/100)。s阳性率为96.23%(102/106),阴性率为3.77%(4/106),基因分析显示均为s1。vacA亚型组合s1/m1阳性率为36.73%,s1/m2组合阳性率为63.27%。结论广州地区Hp儿童分离株vacA的优势基因型为vacAs1、vacAm2、vacAs1/m2。
- 姚淑雯关锐梨龚四堂黄敬杨镒宇谢永强邓秋连周帅周珍文
- 关键词：幽门螺杆菌聚合酶链反应
- NICU患儿呼吸道感染病原菌的分布及耐药性分析被引量：9
- 2012年
- 目的:探讨新生儿重症监护病房(NICU)呼吸道感染常见病原菌的分布及耐药情况,为临床合理选用抗菌药物提供参考。方法:对本院2009年1月至2010年12月NICU患儿送检呼吸道标本所分离病原菌的分布及药敏结果进行统计分析。结果:共检出病原菌367株,分离率前6位的病原菌依次为肺炎克雷伯菌(46.0%)、大肠埃希菌(13.9%)、铜绿假单胞菌(10.9%)、阴沟肠杆菌(8.7%)、金黄色葡萄球菌(5.7%)、真菌(4.9%)。耐药性分析显示,肺炎克雷伯菌耐药情况严重,ESBLs产生率54.4%,对头孢噻肟、头孢曲松的耐药率分别达91.7%、90.5%,对头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、庆大霉素的耐药率分别为68.6%、66.9%、66.9%、47.3%、44.4%,对环丙沙星和阿米卡星的耐药率较低,分别为7.7%和16.6%。大肠埃希菌对青霉素、头孢菌素类的耐药率较高,对亚胺培南、环丙沙星和阿米卡星敏感或较为敏感,ESBLs产生率51.0%,未检出对亚胺培南耐药的肠杆菌科细菌。铜绿假单胞菌除对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松和头孢噻肟的耐药率较高外,对其余抗生素较为敏感或高度敏感。金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素耐药率较高,分别为95.2%、71.4%,对克林霉素、头孢他啶、头孢西丁、阿莫西林/棒酸的耐药率则较低,分别为23.8%、23.8%、14.3%、4.7%,检出MARSA 3株(14.3%),未发现万古霉素耐药的菌株;检出4株肺炎链球菌全部对红霉素的耐药,对β-内酰胺类药物耐药性不严重。结论:肺炎克雷伯菌为NICU患儿呼吸道感染的主要病原菌,且对常用抗生素耐药情况严重。根据病原菌种类及药敏结果合理应用抗菌药是有效控制危重病患儿感染和减少耐药菌株产生的重要手段。
- 钟玉葵邓秋连钟华敏谢永强刘旻周珍文
- 关键词：新生儿重症监护病房呼吸道感染病原菌耐药性
- 幽门螺杆菌儿童分离株尿素酶基因B的克隆及序列分析被引量：5
- 2009年
- 目的克隆幽门螺杆菌(Hp)临床儿童分离株尿素酶B(UreB)基因入pGEX-4T-1表达载体,并进行测序及基因比对分析,为以UreB作为Hp疫苗分子的口服疫苗研制奠定基础。方法根据GenBank中HpUreB序列,设计一对特异性引物PCR扩增Hp临床儿童分离株UreB全长基因,EcoRI及NotI酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及基因测序,并对测序结果进行比对分析。结果以Hp儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了UreB基因,基因大小为1710bp,重组pGEX-4T-1-Ure双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示UreB在正确阅读框中,序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%。Hp儿童分离株GZCH1UreB序列已登录GenBank(登录号:FJ455126)。结论从Hp儿童分离株GZCH1中成功克隆了UreB基因,为UreBHp口服疫苗研制奠定了基础。
- 周珍文邓秋连夏慧敏耿岚岚梁伟河谢永强黄勇龚四堂
- 关键词：幽门螺杆菌克隆儿童
