国家自然科学基金(31070083)
- 作品数：9 被引量：14H指数：2
- 相关作者：张杰宋福平彭琦杜立新邱丽丽更多>>
- 相关机构：中国农业科学院植物保护研究所东北农业大学河北省农林科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 苏云金芽胞杆菌clpP基因缺失对碱刺激敏感性的影响被引量：1
- 2013年
- 【目的】比较苏云金芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌在碱性培养条件下生长情况,明确clpP基因在碱刺激条件下的作用。【方法】采用同源重组技术敲除苏云金芽胞杆菌HD73菌株clpP基因,通过在不同pH下生长曲线的测定明确了clpP基因缺失突变体对碱性环境的敏感性,测定clpP基因的缺失对芽胞形成率、芽胞萌发效率和盐胁迫的影响。【结果】苏云金芽胞杆菌在碱刺激后,当培养基pH值为8.9-9.1时可以恢复生长,而枯草芽胞杆菌在pH值为8.2-8.4时可以恢复生长,说明苏云金芽胞杆菌对碱性环境适应能力更强,这有助于作为病原菌的Bt适应昆虫中肠的碱性环境。clpP基因缺失对芽胞形成率和萌发效率没有明显的影响。在将培养基中NaOH终浓度调节至30 mmol/L NaOH时,clpP基因缺失突变体的生长较出发菌株慢。说明ClpP在苏云金芽胞杆菌对碱性环境的适应过程中具有重要作用。
- 邱丽丽彭琦曲宁刘春霞李杰张杰宋福平
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- 苏云金芽胞杆菌sigK基因插入失活突变体的特点及其对cry3A基因启动子活性的影响被引量：3
- 2011年
- 【目的】构建苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)sigK基因插入失活突变体,分析突变体特点并明确其对cry3A基因启动子的影响。【方法】采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73菌株sigK基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK基因插入失活突变体。通过生长曲线测定、扫描电子显微镜观察晶体、芽胞形成情况和芽胞计数及SDS-PAGE等方法分析了突变体的特点;构建了遗传恢复菌株对上述性状进行了功能验证;利用启动子融合lacZ技术检测了cry3A基因启动子的转录活性。【结果】获得了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株sigK基因突变体,生长曲线测定表明,突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力;SDS-PAGE分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株和恢复菌株。利用载体pHT315携带sigK基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力;sigK基因的突变可以提高cry3A基因启动子在产胞后期的转录活性,对cry3A启动子指导的Cry蛋白表达量没有显著影响。【结论】本研究证明sigK基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量;sigK基因功能的丧失有利于cry3A基因启动子在产胞后期的转录。
- 杜立新魏娟韩丽丽陈榛张杰宋福平黄大昉
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- γ-氨基丁酸代谢旁路阻断对苏云金芽胞杆菌芽胞形成和晶体蛋白产量的影响被引量：2
- 2012年
- γ-氨基丁酸旁路(GABA shunt)普遍存在于原核和真核生物体中,对于动物、植物和微生物具有不同的生理功能。苏云金芽胞杆菌gab基因簇中gabT和gabD基因所编码的γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶参与GABA shunt。在前期研究获得的苏云金芽胞杆菌HD-73菌株gabT、gabR(gab基因簇中的调控基因)和gabD基因缺失突变菌株的基础上,从菌株生长、芽胞产量和晶体蛋白产量等方面研究GABA shunt阻断对Bt芽胞和晶体形成的影响。结果表明,GABA shunt阻断对芽胞产量有一定影响,但对Bt生长和晶体蛋白产量无明显影响。
- 王维高继国朱莉彭琦束长龙张杰黄大昉宋福平
- 关键词：苏云金芽胞杆菌晶体蛋白
- SigmaK和GerE对芽胞外壁基质结构基因exsB的转录调控被引量：1
- 2013年
- 【目的】明确SigmaK和GerE对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)芽胞外壁(exosporium)基质结构基因exsB的转录调控。【方法】序列比较蜡样芽胞杆菌群exsB及启动区序列,利用启动子融合lacZ技术检测exsB启动子的转录活性;通过凝胶阻滞方法检测GerE与exsB启动子的结合。【结果】在蜡样芽胞杆菌群中,exsB及其启动区具有较高的相似性,exsB启动子在芽胞形成期的晚期大量转录;sigK和gerE的突变影响了exsB启动子的转录活性,凝胶阻滞结果显示GerE蛋白与exsB启动子可以结合。【结论】本研究证明exsB在芽胞形成晚期受到SigmaK转录调控,并直接受到GerE的正调控。
- 曲宁彭琦邱丽丽刘春霞陈榛张杰宋福平李杰
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- 四种cry基因启动子在spoIIID基因突变株中的活性比较被引量：1
- 2012年
- 【目的】分析spoIIID基因突变对苏云金芽胞杆菌cry1、cry3、cry4和cry8基因启动子Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E的影响,比较以上启动子在无芽胞spoIIID基因突变体(HD-△SpoIIID)中的转录活性。【方法】分别构建了Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合的转录分析载体,并导入HD-73野生型菌株和HD-△SpoIIID突变株中测定β-半乳糖苷酶活性;通过高温诱变方法在HD-△SpoIIID基础上筛选出缺失cry1Ac基因的HD--△SpoIIID突变体;构建了4种启动子与cry1Ac基因融合表达载体,分别将它们转入HD-ΔSpoIIID和HD--ΔSpoIIID中,分析Cry1Ac蛋白表达量及其生物活性。【结果】HD-73和HD-ΔSpoIIID菌株中四个启动子转录活性由高到低分别为:Pcry8E>Pcry1Ac>Pcry4A>Pcry3A;spoIIID基因的缺失未影响Pcry1Ac和Pcry8E转录活性,Pcry3A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性略有升高,Pcry4A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性在T5到T10略有降低。从翻译水平来看在HD-ΔSpoIIID中cry8E启动子略低于cry1Ac启动子,并高于Pcry4Aa,Pcry3A指导的Cry1Ac蛋白产量,生物活性测定结果与蛋白表达量相符。【结论】cry8E基因启动子Pcry8E在spoIIID突变体中在转录水平活性是最高的启动子,而cry1Ac启动子指导自身基因cry1Ac表达时,在翻译水平上略高于cry8E启动子指导的Cry1Ac产量。
- 王新梅杜立新彭琦梁影屏李杰张杰宋福平
- 关键词：苏云金芽胞杆菌转录活性
- 苏云金芽胞杆菌sigL基因的缺失对菌体碳氮源利用的影响
- 2013年
- sigL基因编码的产物σ54是许多重要代谢途径的转录因子。为研究sigL基因在苏云金芽胞杆菌中的功能,试验分别测定苏云金芽胞杆菌HD-73菌株和sigL基因缺失突变菌株在基本培养基中对不同碳氮源的利用。结果表明,出发菌株和sigL突变体都不能利用果糖、蔗糖、纤维二糖、柠檬酸作为唯一碳源;sigL突变菌株不能利用肌氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸为唯一氮源,说明sigL缺失可能阻碍这些氨基酸参与的代谢途径。β-半乳糖苷酶活性分析表明,调控肌氨酸代谢途径的soxR基因转录活性在sigL突变体中降低,说明sigL是通过调控编码肌氨酸氧化酶的基因簇(sox)而影响菌体对肌氨酸的利用。
- 彭琦刘刚束长龙张杰黄大宋福平
- 关键词：苏云金芽胞杆菌碳氮源
- 母细胞产生内含物的芽胞杆菌分析
- 2012年
- 在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)分离过程中发现有些芽胞杆菌产生与Bt相似的芽胞,但并不形成伴胞晶体,特别是发现它们在芽胞期的母细胞中含有丰富的内含物,对该类菌株的性质需要进一步明确。本研究选择6株该类型的菌株,对其种属、质粒、蛋白谱和杀虫活性等进行了初步分析。芽胞形态和质粒图谱分析结果显示,其与Bt菌株相似;肽指纹图谱分析发现选取的蛋白与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)族细菌的蛋白匹配度最高;16SrDNA聚类研究表明,所分离的菌株的确与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)族(包括Bc和Bt)同源性最高;从生物杀虫活性测定来看11-1菌株上清液对小菜蛾(Plutella xylostella)的校正死亡率达75.9%,而85-1和11-1菌株上清对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的校正死亡率分别能达到100%和87.9%。本研究结果表明在Bt菌株的分离过程中,对于没有形成晶体但在芽胞形成时期还有内含物的菌株也应加以重视,这些菌株属于B.cereus族,具有潜在利用价值。
- 陈榛邵高祥韩丽丽束长龙张杰宋福平
- 关键词：肽指纹图谱芽胞杆菌
- cry8E启动子指导的非晶体蛋白GabR在苏云金芽胞杆菌HD73菌株中的表达被引量：2
- 2014年
- 【目的】利用cry8E基因启动子指导的高效表达载体pHT315-8E21b,构建一个能够在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)中正确表达非晶体蛋白GabR的重组菌株。【方法】将苏云金芽胞杆菌中的功能基因gabR装载到cry8E基因启动子指导的高效表达载体pHT315-8E21b上,转入到HD73-无晶体突变株后获得重组菌株HD-8E-gabR。通过SDS-PAGE和凝胶阻滞等方法对GabR蛋白的表达和功能进行分析。【结果】通过SDS-PAGE及蛋白定量等方法首次证明了在Bt表达体系中cry8E基因启动子指导的高效表达载体能够表达非晶体蛋白GabR,且通过碱裂解的方法可以提高GabR蛋白在Bt系统中的溶解性。进一步凝胶阻滞试验证明GabR能与其调控启动子PgabT结合。【结论】证明了cry8E基因启动子指导的Bt表达系统具有大量表达非晶体类蛋白的能力。
- 刘春霞武建博彭琦曲宁邱丽丽张杰宋福平
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- 苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建被引量：5
- 2013年
- 【目的】通过比较cry1A、cry3A、cry4A和cry8E四个基因的启动子转录活性,筛选出一个强启动子,利用强启动子构建一个苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)高效表达载体。【方法】利用启动子融合lacZ技术检测了4种启动子的转录活性。通过扫描电子显微镜观察晶体、SDS-PAGE、蛋白定量和生物活性测定等方法对新建高效表达载体进行功能验证。【结果】构建了Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E 4个启动子融合报告基因lacZ的表达载体,经β-半乳糖苷酶活性分析得知,启动子活性从高到低依次为Pcry8E>Pcry1A>Pcry4A>Pcry3A。选取cry8E启动子,以pHT315作为基础载体构建苏云金芽胞杆菌高效表达载体pHT315-8E21b,将cry1Ac基因连接到pHT315-8E21b和广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY-422b上,分别转入无晶体突变株HD-73?,获得菌株HD-8E1Ac和HD-422-1Ac。扫描电子显微镜观察显示,HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体,说明正确表达了cry1Ac基因。SDS-PAGE分析结合蛋白定量实验表明pHT315-8E21b表达效率高于pSXY-422b。对小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性测定表明HD-8E1Ac菌株对小菜蛾有生物活性,且菌株活性高于HD-422-1Ac。【结论】利用强启动子Pcry8E构建了一个能在Bt中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b,该载体可正确表达cry1Ac基因,其表达效率高于被广泛应用的pSXY422b。
- 李朝睿杜立新彭琦梁影屏高继国张杰宋福平
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
