国家自然科学基金(30801140)
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
- 相关作者：袁坚雷鸣李逊曾国华何朝晖更多>>
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- 克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义被引量：2
- 2010年
- 目的研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能。方法成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析。结果重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确。成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能。结论克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础。
- 赖德辉李逊雷鸣曾国华袁坚吴文起何永忠何朝晖
- 关键词：FRC基因克隆
- 肠源性高草酸尿大鼠模型的建立被引量：1
- 2014年
- 目的：建立肠源性高草酸尿的大鼠模型。方法随机选取30只雌性SD大鼠置于大鼠代谢笼中适应性喂养7 d之后收集24 h尿，记录尿量，采用离子色谱仪测定其草酸浓度，计算正常大鼠在该条件下24 h尿草酸排泄量。菠菜汁灌胃处理大鼠，再测定灌胃后24 h尿草酸排泄量。对比灌胃菠菜汁前后，大鼠24 h尿草酸排泄量的差别；分组对照实验，随机选取20只雌性SD大鼠，随机分成A组和B组，B组灌胃菠菜汁，A组灌胃等量纯净水，其他条件相同，比较两组24 h尿草酸排泄量。结果反复测定，正常大鼠灌胃菠菜汁前24 h尿草酸排泄量为（0.53±0.18） mg，灌胃菠菜汁后第1天为（1.93±0.36） mg，第3天为（1.85±0.38） mg，第7天为（2.03±0.39） mg；A组（0.44±0.12） mg，B组（1.68±0.38） mg。结论大鼠在灌胃菠菜汁之后其尿液24 h草酸排泄量明显增加，大概增加3~4倍，说明每天对大鼠进行定量定浓度的菠菜汁灌胃，可以使其保持长期的高草酸尿状态，该方法建立的肠源性高草酸尿大鼠模型简便可行，可广泛用于其他方面的研究。
- 陈清江李逊雷鸣何永忠
- 关键词：大鼠模型
- 产甲酸草酸杆菌基因frc和OXC在人骨髓间充质干细胞中的表达被引量：1
- 2012年
- 目的:将产甲酸草酸杆菌(OXF)草酸分解基因frc和oxc分别克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1和pBaBE-puro,共转染正常成人骨髓间充质干细胞(hMSCs),使frc和oxc基因在hMSCs中稳定表。方法:以本实验室保存的OXF基因组为模板,PCR法扩增出frc和oxc基因的编码序列,采用逆转录病毒载体将frc和oxc导入hMSCs中,Q-PCR和Western blot检测其表达。结果:重组载体pLEGFP-N1-myc-frc、pBaBE-puro-flag-oxc构建成功;并检测出frc和oxc基因在hMSCs中的稳定表达。结论:逆转录病毒载体介导的frc和oxc能成功转染hMSCs,能为以后体外诱导分化为肝细胞,治疗内源性高草酸尿奠定基础,为下一步的实验提供原材料。
- 阳旭明袁坚雷鸣张泽
- 关键词：高草酸尿骨髓间充质干细胞逆转录病毒载体
- 构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系
- 2013年
- 背景: 高草酸尿是结石形成的危险因素之一,利用基因工程和干细胞技术构建具有高代谢草酸能力的细胞系,将成为防治草酸钙结石的有效手段。目的: 将产甲酸草酸杆菌的草酸分解基因Frc和Oxc共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,使之获得分解草酸的功能。方法: PCR法扩增出Frc和Oxc基因的编码序列,构建真核表达载体pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc,将其共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,以转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞作为对照。采用Westernblot检测目的基因表达情况;离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度。结果与结论: 酶切鉴定和测序结果显示实验成功扩增了Frc和Oxc基因,并构建了pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc载体。将其转染至正常成人骨髓间充质干细胞后,Westernblot检测结果显示其可稳定表达目的蛋白myc-甲酰辅酶A转移酶和flag-草酰辅酶A脱羧酶;离子色谱仪检测结果显示,随着培养时间的延长,转染目的基因的人骨髓间充质干细胞培养液中草酸浓度逐渐下降。而转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞无目的蛋白表达,也无分解草酸能力。说明实验成功构建了可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,该细胞系可稳定表达草酸分解蛋白Frc和Oxc,并具有草酸分解能力。
- 阳旭明袁坚雷鸣张泽
- 关键词：干细胞骨髓间充质干细胞高草酸尿反转录病毒载体FRCOXC
- 体外诱导可分解草酸成人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的研究
- 2013年
- 目的体外培养并转染了产甲酸草酸杆菌（Ox-F）草酸分解基因h℃和oxe的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs—fre—oxe），并诱导其向肝细胞分化。方法体外培养转染了草酸分解基因的P4代hMSCs，并通过含40μg/L肝细胞生长因子（HGF）＋10μg／L胰岛素样生长因子（FGF）-4所组成的培养液诱导其向肝细胞分化。在分化过程中通过显微镜观察分化细胞形态变化。以实时定量聚合酶链反应（Real—timePCR）、Westernblot技术和免疫细胞化学技术检测细胞内肝细胞特异标志物甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白-18（CK-18）和目的基因frc、OXC及其产物融合蛋白mye—FCOAT、flag—OCOAD的表达。成熟肝细胞L-02和转染了空病毒载体的hMSCs（hMSCs．vector）分别作为阳性对照组和阴性对照组。结果可分解草酸的hMSCs—frc—OXC在体外可成功培养，细胞经上述培养液诱导后，细胞形态逐渐变短，变成多角形。Real—timePCR可检测在诱导组细胞中AFP、ALB、CK—18和草酸分解基因frc、OXe表达，而未经诱导细胞组AFP、ALB、CK-18则未表达，未转染目的基因的细胞组fre、oxe未见表达。免疫细胞化学检测诱导28d后细胞可表达ALB，未经诱导细胞组ALB表达呈阴性。Westernblot技术检测诱导第14、28天细胞中AFP、CK-18表达较未诱导组明显增加（P〈0．05），与成熟肝细胞相似，并表达myc-FCOAT、flag—OCOAD，而未转染目的基因细胞组表达呈阴性。结论含有草酸分解基因的hMSCs—frc—OXC体外通过一定条件诱导可以向肝细胞方向分化，经诱导分化后细胞仍可成功表达frc和oxe基因及其产物。
- 朱玮袁坚雷鸣李舒珏刘向崇
- 关键词：骨髓间充质干细胞细胞分化肝细胞
- 肾胺酶预防大鼠缺血再灌注致急性肾损伤的机制研究被引量：5
- 2016年
- 目的探讨肾胺酶在预防肾脏缺血再灌注(IR)致急性肾损伤(AKI)的作用及机制。方法选择36只SD大鼠制作IR-AKI模型,随机分成假手术组(仅游离出双侧肾蒂,不夹闭肾动脉)、空白对照组(IR组,缺血前30 min腹腔注射生理盐水)、肾胺酶干预组(IR+肾胺酶组,缺血前20 min腹腔注射肾胺酶1 mg/kg)3组。于IR 18 h后,取肾脏组织行苏木素-伊红染色和免疫组织化学检查,光镜下观察病理学改变,比较凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平;静脉采血测血尿素氮、血清肌酐和丙二醛含量。结果 IR+肾胺酶组的血清肌酐、血尿素氮和丙二醛水平和急性肾小管坏死指数均低于IR组(P均<0.01)、高于假手术组(P均<0.01)。IR+肾胺酶组的Bcl-2蛋白表达均高于IR组和假手术组(P<0.01)。IR+肾胺酶组的Bax蛋白表达低于IR组(P<0.01)、高于假手术组(P<0.01)。结论肾胺酶可减轻肾脏IR导致的AKI,其机制可能是通过抑制氧化应激产物的产生,并与上调Bcl-2抗凋亡蛋白和下调Bax促凋亡蛋白表达有关。
- 吴永东汪华林林蓉宇蒋强袁春玲
- 关键词：缺血再灌注急性肾损伤氧化应激凋亡
- 基因工程构建表达融合蛋白GST-FCoAT的益生大肠杆菌EcN-Frc被引量：3
- 2010年
- 目的:将产甲酸草酸杆菌代谢草酸基因Frc克隆至表达载体PGEX-4T-2,转化大肠杆菌EcN,稳定表达甲酰辅酶A转移酶。方法:采用PCR方法从产甲酸草酸杆菌基因组中获得Frc基因,插入到载体PGEX-4T-2,转化EcN,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,产物行western-blot鉴定分析。结果:EcN-Frc可稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT。结论:改造后的EcN能诱导表达甲酰辅酶A转移酶,将为下一步体内外代谢草酸实验和临床治疗高草酸尿和防治草酸结石的益生菌制剂的研究奠定基础。
- 赖德辉李逊雷鸣曾国华袁坚吴文起何永忠何朝晖
- 关键词：FRC基因克隆
