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反转录病毒载体介导的EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达被引量：1: 2011年; 为了构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的反转录病毒载体,并观察EGFP基因在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中的表达情况。试验将增强型绿色免疫荧光基因片段定向插入反转录病毒载体pFB-neo,获得重组反转录病毒质粒pFB-NE,利用三质粒共转染系统,将含有目的基因的重组反转录病毒质粒pFB-NE以及含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK-293细胞,用产生的重组反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,并在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达。结果表明:重组反转录病毒载体pFB-NE构建正确,重组病毒包装成功,EGFP基因在细胞中能够稳定表达。; 王婧李昌李林溪胡博丛艳昭任大勇王卓越杜寿文金宁一; 关键词：反转录病毒载体

乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472 usp 45基因的克隆与原核表达被引量：3: 2014年; 从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组中PCR扩增usp 45基因,与pMD-18T载体连接获pT-usp 45质粒;酶切鉴定并测序正确后,将usp 45基因克隆入原核表达载体pET-28a,获重组质粒pET-28a-usp 45,转入E.coli BL21(DE3);经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化,由SDS-PAGE和Westren blot进行鉴定。结果表明,本试验获得1 371 bp长度的usp 45基因,构建pET-28a-usp 45质粒,诱导表达并纯化分子量约50 kDa的目的蛋白,为进一步研究usp 45蛋白奠定基础。; 叶飞李昌任大勇秦艳青朱翯杜寿文金宁一; 关键词：乳酸菌 USP 分泌蛋白原核表达

乳酸乳球菌高效电转化方法的建立被引量：8: 2012年; 以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明:在固定电阻200Ω、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2 mm规格的电击杯,加入浓度为1.2μg/μL的质粒,在电场强度和脉冲时间分别为10 kV/cm和5 ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2 h后涂板计数,转化效率最高可以达到2.6×104 CFU/μg DNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。; 任大勇李昌秦艳青杜寿文郭欢欢刘宏锋洛阳金宁一; 关键词：乳酸乳球菌电转化感受态细胞

新型鸡痘病毒穿梭载体的构建及其体外表达被引量：5: 2012年; 为构建用于筛选的新型鸡痘病毒载体,采用染色体步移技术对鸡痘病毒282E4株TK基因的下游序列进行测序,并结合扩增出的左右同源重组臂TKL、TKR片段、启动子、MCS及终止信号构建出三表达盒穿梭载体pTKE3。采用基因工程技术将绿色荧光蛋白EGFP基因克隆入3个启动子的下游,构建出pTKE3-A、pTKE3-B、pTKE3-C验证表达盒质粒。结果显示,构建的3个验证质粒分别与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,均可在转染12h后观察到绿色荧光。结果表明,构建的三表达盒载体均可成功表达外源基因,这为进一步构建多价重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定了基础。; 刘存霞李昌王茂鹏胡乐鹏靖杰杜寿文尹荣兰刘燕瑜任静强任大勇孙丹丹金宁一; 关键词：鸡痘病毒穿梭载体

人树突状细胞分离与鉴定最新研究进展被引量：3: 2013年; 树突状细胞（dendriticcell，DC）是最重要的抗原提呈细胞．在许多疾病过程中发挥免疫调节作用。DC的发现者Steinman对它在获得性免疫中的作用进行了深入研究。Beutler深人探讨了DC在固有免疫中的作用．2011年他们以此获得诺贝尔生理或医学奖，充分表明DC在免疫学领域的重大意义。; 王茂鹏杜寿文李昌金宁一; 关键词：树突状细胞细胞分离诺贝尔生理或医学奖抗原提呈细胞获得性免疫疾病过程

新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证被引量：1: 2011年; 目的:构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法:设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassetteⅡ),在其上下游添加NruⅠ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用NruⅠ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,NruⅠ及BglⅡ/PstⅠ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果:两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论:成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。; 杜寿文李昌王宇航任大勇刘存霞孙丹丹朱娜李沂秦艳青金宁一; 关键词：EGFP

HIV-1 B亚型假病毒的制备与鉴定被引量：1: 2014年; 目的制备携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和ENV包膜蛋白的HIV-1 B亚型假病毒用于感染研究,并建立可行的鉴定方法。方法双质粒共转染HEK293T细胞后收获病毒上清,TRIzol法提取病毒基因组并采用RT-PCR进行报告基因扩增,Western印迹和ELISA法检测病毒P24抗原。假病毒感染HIV-1允许细胞,进行报告基因检测、病毒滴度测定以及单轮感染活性实验研究。结果与结论建立了HIV-1假病毒制备与鉴定方法,制备获得了B型HIV-1假病毒,经鉴定具备感染SupT1和TZM-bl细胞能力,为HIV-1与宿主细胞相互作用研究奠定了基础。; 王茂鹏李昌杜寿文朱羿龙朱娜孙丹丹金宁一; 关键词：HIV-1

Immunogenicity analysis following human immunodeficiency virus recombinant DNA and recombinant vaccinia virus Tian Tan prime-boost immunization被引量：7: 2013年; This study assessed and compared the immunogenicity of various immunization strategies in mice using combinations of re- combinant DNA （pCCMp24） and recombinant attenuated vaccinia virus Tian Tan （rddVTT_ccMpe4）. Intramuscular immuniza- tion was performed on days 0 （prime） and 21 （boost）. The immunogenicity of the vaccine schedules was determined by meas- uring human immunodeficiency virus （HIV）-specific binding antibody levels and cytokine （interleukin-2 and interleukin-4） concentrations in peripheral blood, analyzing lymphocyte proliferation capacity against HIV epitopes and CD4~/CD8＋cell ratio, and monitoring interferon-gamma levels at different times post-immunization. The results showed that pCCMp24, rddVTT.ccMp24 and their prime-boost immunization induced humoral and cellular immune responses. The pCCMp24/ rddVTT.ccMp24 immunization strategy increased CD8＋ T cells and induced more IFN-7-secreting cells compared with sin- gle-shot rDNA. The prime-boost immunization strategy also induced the generation of cellular immunological memory to HIV epitope peptides. These results demonstrated that prime-boost immunization with rDNA and rddVTT_ccMp24 had a tendency to induce greater cellular immune response than single-shot vaccinations, especially IFN-7 response, providing a basis for further studies.; LIU CunXiaDU ShouWenLI ChangWANG YuHangWANG MaoPengLI YiYIN RongLanLI XiaoREN DaYongQIN YanQingREN JingQiangJIN NingYi; 关键词：PRIME-BOOST IMMUNOGENICITY

表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选被引量：3: 2014年; 构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化。结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础。; 朱羿龙李昌郭焱刘存霞杜寿文王茂鹏金宁一; 关键词：重组鸡痘病毒 HIV-1 GAG

IFITM3基因的克隆及其在真核细胞中的表达与定位研究被引量：1: 2012年; 目的:干扰素rhIFN-α2B体外诱导人胚胎肾细胞系293T细胞获得IFITM3基因,观察IFITM3基因在293T细胞中的表达与定位。方法:利用干扰素rhIFN-α2B体外诱导293T细胞获得IFITM3基因,采用RT-PCR技术扩增获得干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3全长cDNA,扩增产物连接至pMD18-T载体上,测序正确后,将IFITM3基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中获得重组质粒pV-IFITM3,通过转染293T细胞进行表达与定位研究。结果:RT-PCR和Western blot结果表明,获得的目的基因IFITM3能够表达,且具有良好抗原活性;激光共聚焦显微镜观察显示,IFITM3基因表达后主要分布于细胞膜上。结论:成功获得IFITM3基因,并验证了其表达。该研究为基于IFITM3的抗病毒药物以及探讨其抗病毒机制研究奠定了坚实基础。; 朱娜李昌郭焱李沂孙丹丹任静强杜寿文秦艳青王茂鹏田宇飞金宁一; 关键词：克隆

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