目的探讨高压力培养下角膜内皮细胞凋亡的启动机制。方法原代兔角膜内皮细胞经免疫组织化学鉴定后,在50mm Hg(1 k Pa=7.5 mm Hg)压力条件下,培养1 h、2 h、24 h,另设正常压力(15 mm Hg)作为正常压力组,培养24 h。第一代兔角膜内皮细胞融合达70%~80%后,细胞在加压前1 h分别使用浓度均为10^(-6)mol·L^(-1)抗Caspase-8和抗Caspase-9预处理,然后置于压力装置中,压力设定为50 mm Hg,培养24 h后检测蛋白Bcl-2和P53表达,并且以无抑制剂处理的50 mm Hg压力培养的细胞为对照组。各组培养的细胞均经Western blot检测Bcl-2和P53的表达。免疫荧光染色检测兔角膜内皮细胞胞浆细胞色素C的含量。结果 50 mm Hg压力组角膜内皮细胞,加压1 h、2 h、24 h P53的表达量分别为0.651±0.007、0.805±0.006、0.839±0.011,较正常压力组(0.033±0.004)升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);50 mm Hg压力组随着加压时间的延长,角膜内皮细胞中P53蛋白表达量逐渐增加,各时间两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。50 mm Hg压力组中加压1 h、2 h、24 h Bcl-2的表达量分别为0.590±0.009、0.724±0.005、0.314±0.016,较正常压力组(0.081±0.013)反应性升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);50 mm Hg压力组各时间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.01)。实验发现正常压力组培养24 h后,细胞核呈蓝色,胞浆中无细胞色素C释放;50 mm Hg压力组培养1 h可见部分细胞胞浆呈红色,提示细胞色素C释放进入到胞浆内,随着加压时间延长荧光强度增加,加压24 h见胞浆内出现广泛红色强荧光。抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组的角膜内皮细胞P53表达量分别为0.535±0.007、0.703±0.010,较对照组(0.727±0.021)下调,差异均有统计学意义(均为P<0.01);抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组中Bcl-2的表达量呈抑制性下降,分别为0.312±0.003、0.442±0.011,较对照组(0.501±0.011)下降,差异均有统计学意义(均为P
目的探讨高压力对兔角膜内皮细胞损伤的微观机制。设计实验研究。研究对象仿生培养的兔角膜内皮细胞。方法将体外培养的第一代兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells,RCEC)分为五组:A组30 mm Hg压力组,B组压力波动组,将压力设为15~25~20~10 mm Hg,每个压力持续6小时,C组50 mm Hg压力组,D组正常压力组,E组无压力组。免疫法鉴定原代角膜内皮细胞;流式细胞术检测细胞活性;Western蛋白印迹法检测细胞中蛋白Bc L-2和P^(53)表达;RT-PCR检测Fas/Fas L的表达;免疫荧光检测细胞胞浆细胞色素C(Cytc)的表达。主要指标兔角膜内皮细胞蛋白Bc L-2、P^(53)表达以及Fas/Fas L和Cytc的表达。结果获取的所有细胞证实为角膜内皮细胞表型,无角膜上皮细胞及基质细胞污染。细胞分别培养24 h后,流式细胞术分析发现高压力组细胞存活率明显下降,而受损的细胞大部分处于凋亡状态;Western蛋白印迹法结果显示:在30 mm Hg组、50mm Hg组和压力波动组中蛋白P53相对表达量(OPTDI_(P53)/OPTDI_(actin))分别为(0.253±0.014)、(0.670±0.019)、(0.474±0.016),明显高于正常压力组(0.009±0.003)(F=1210,P=0.000);RT-PCR检测各组中各时间段Fas/Fas L的表达均为阴性;在高压力组中,免疫荧光检测发现细胞胞浆中Cytc呈阳性表达。结论高压力对角膜内皮细胞损伤是通过细胞凋亡介导,而压力调控下细胞凋亡途径的启动是角膜内皮细胞Cytc从线粒体释放入胞浆,通过激活凋亡的内源性途径实现。
目的观察波动的压力对角膜内皮细胞的影响。方法将体外培养的第一代兔角膜内皮细胞分为两组:A组为压力波动组(压力设置为:15 mm Hg^25 mm Hg^20 mm Hg^10 mm Hg,每个压力持续6 h;1 kPa=7.5 mm Hg);B组为30 mm Hg压力组;C组为无压力组。三组细胞分别培养24 h。免疫细胞化学染色法鉴定原代角膜内皮细胞形态;台盼蓝-茜素红联合染色检测细胞活性,HE染色观察细胞形态;Western-blotting检测细胞中Bcl-2和P53蛋白的表达水平。结果获取的所有细胞证实为角膜内皮细胞表型,无角膜上皮细胞及基质细胞污染。三组细胞分别培养24 h后,经台盼蓝-茜素红染色和HE染色证实:两个压力培养组的细胞活性较无压力培养组明显下降,其中压力波动组的细胞活性低于30 mm Hg压力组。同时无压力组、30 mm Hg压力组和压力波动组细胞中P53蛋白的相对表达量分别为0.150±0.005、0.253±0.014、0.670±0.019,差异有统计学意义(P<0.05)。结论证实了高压力及非生理性波动的压力对角膜内皮细胞均具有损伤作用。
