深圳市科技计划项目(201101015)
- 作品数：12 被引量：24H指数：4
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- CYP3A4沉默细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响被引量：1
- 2014年
- 目的构建CYP3A4基因沉默载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4沉默细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到pLKO.1-puro中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4沉默细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP3A4沉默细胞进行染毒12h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)表达变化。结果测序证明插入pLKO.1-puro载体的干扰序列与设计的序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常L02肝细胞下降77.3%,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常L02肝细胞下降84.6%。CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02细胞的表达水平;Caspase-3表达水平无明显改变;Caspase-8仅在TCE高剂量组表达下降;Caspase-9在TCE剂量≥1.0 mmol/L表达水平下降;癌基因c-fos、c-myc、k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论三氯乙烯对正常肝细胞和CYP3A4沉默细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系。
- 徐新云毛侃琅袁建辉毛吉炎吴德生黄海燕谢杏秦逍云谭琴
- 关键词：肝细胞CYP3A4慢病毒载体三氯乙烯
- CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定
- 2014年
- 目的:应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法:根据GenBank提供的CYP2E1基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果:测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论:成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制研究。
- 徐新云毛侃琅周丽吴德生毛吉炎谢杏秦逍云谭琴
- 关键词：CYP2E1基因慢病毒载体过表达
- 细胞色素氧化酶2E1基因沉默对三氯乙烯致L02肝细胞毒性的影响被引量：5
- 2013年
- 目的通过RNA干扰技术，构建细胞色素氧化酶（CYP）2E1基因慢病毒表达载体，研究CYP2E1基因沉默对三氯乙烯（TCE）致肝细胞毒性的影响。方法设计合成shRNA片段连接到慢病毒载体，筛选单菌落，经聚合酶链式反应（PCR）和测序鉴定后提取质粒，转导L02肝细胞中，筛选CYP2E1缺陷型细胞，利用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法（Westernblot）鉴定干扰效果。以不同浓度（0、0．25、0．50、1．00、2．00、4．00mmol/L）TCE分别对L02肝细胞和CYP2E1基因沉默细胞染毒，测定TCE对2种细胞的存活率及IC50，应用流式细胞仪测定细胞凋亡率，采用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡基因和癌基因mRNA表达水平。结果正常L02肝细胞对TCE的IC50为15．1mmol／L，CYP2E1沉默细胞对TCE的IC50为23．6mmol／L。随TCE剂量增加两组细胞凋亡率升高，2．0、4．0mmol／LTCE染毒剂量时，CYP2E1沉默细胞的凋亡率明显低于L02肝细胞组，差异有统计学意义（P〈O．05或P〈0．01）。TCE染毒后CYP2E1沉默细胞的抗凋亡基因Bcl-2表达水平比L02肝细胞升高15％-60％，凋亡基因caspase-3和caspase-9表达水平比L02肝细胞下降30％-60％，差异均有统计学意义（尸〈O．01）。抑癌基因p53表达水平明显高于L02肝细胞，升高81％-278％；癌基因c．fos和k-ras明显低于L02肝细胞组，下降20％～68％，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论利用慢病毒介导RNA干扰技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。沉默CYP2E1基因可降低TCE对肝细胞毒性，抑制部分凋亡基因与癌基因表达，提示CYP2E1基因在三氯乙烯代谢过程中发挥重要作用，与三氯乙烯毒性存在一定关系。
- 徐新云毛吉炎毛侃琅刘国红慈捷元杨细飞吴德生黄海燕张然黄新凤
- 关键词：三氯乙烯慢病毒载体基因沉默
- CYP3A4高表达肝细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响
- 2013年
- 目的建立CYP3A4高表达肝细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法 PCR扩增CYP3A4基因并将其克隆到慢病毒高表达载体中,将已经构建的慢病毒载体进行转染后,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌罗霉素进行筛选得到CYP3A4高表达肝细胞株,通过荧光定量PCR和Western蛋白质印迹法鉴定细胞株。用三氯乙烯0,0.25,0.5,1.0,2.0和4.0mmol·L-1对正常肝肝细胞和CYP3A4高表达肝细胞进行染毒12h,实时定量PCR检测凋亡基因bcl-2,胱天蛋白酶3,胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9以及癌基因c-fos,c-myc,K-ras和p53的表达。结果测序证明重组慢病毒高表达载体CYP3A4基因序列正确,荧光定量PCR检测CYP3A4高表达肝细胞株比正常肝细胞CYP3A4基因表达提高94倍。Western蛋白质印迹结果显示,CYP3A4高表达肝细胞株CYP3A4蛋白表达水平是正常肝细胞的2.36倍。CYP3A4高表达肝细胞bcl-2mRNA表达水平随三氯乙烯浓度增加呈下降趋势,与正常细胞相比,三氯乙烯0.25和0.5mmol·L-1使CYP3A4高表达肝细胞中的bcl-2mRNA明显升高(P<0.01);三氯乙烯0.5,1.0,2.0和4.0mmol·L-1处理使CYP3A4高表达肝细胞组的凋亡基因胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表达水平明显升高(P<0.05);三氯乙烯0.5,1.0,2.0和4.0mmol·L-1处理的CYP3A4高表达肝细胞c-fos、c-myc和k-ras基因的表达显著升高(P<0.01),p53表达水平明显下降(P<0.01)。结论三氯乙烯对CYP3A4高表达肝细胞株中的凋亡基因和癌基因表达具有明显促进作用,说明CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素。
- 毛侃琅徐新云何晓阳毛吉炎张然谢杏秦逍云
- 关键词：肝细胞细胞色素P-450CYP3A4慢病毒感染三氯乙烯
- 三氯乙烯致细胞免疫和体液免疫参与的混合型变态反应研究被引量：8
- 2014年
- 目的 探讨三氯乙烯(TCE)致变态反应是否存在细胞免疫和体液免疫共同参与,为研究其发病机制提供科学依据.方法 应用豚鼠和大鼠进行实验,分别设立阴性对照组、阳性对照组、TCE实验组,用皮内注射方式分别注射橄榄油、2,4-二硝基氯苯(DNCB)和TCE.实验结束后收集大鼠外周血液,用流式细胞仪检测淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+比例;收集豚鼠外周血液测定IgG、IgA、IgM、C3、C4水平;收集豚鼠脾淋巴细胞,用荧光定量PCR检测免疫相关基因GATA3、T-bet、CTLA4和Foxp3的mRNA表达水平.此外,选取TCE药疹样皮炎患者作为病例组,采用荧光定量PCR检测外周血Foxp3、GATA3、CTLA4、T-bet的mRNA表达水平.结果 (1)TCE对豚鼠皮肤有明显致敏作用,致敏率为83.3％;TCE实验组和阳性对照组IgG水平比阴性对照组显著升高(P＜0.01);TCE实验组和阳性对照组GATA3、T-bet、CTLA4 mRNA表达水平显著高于阴性对照组,Foxp3 mRNA表达水平低于阴性对照组.(2)TCE实验组和阳性对照组大鼠外周血淋巴细胞CD3+比例高于阴性对照组,TCE实验组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与阴性对照组比较无统计学差异.(3)TCE病例组Foxp3、GATA3、CTLA4 mRNA表达水平比对照组分别升高115％、97％和241％(P＜0.01),T-bet mRNA表达水平下降47％(P＜0.01).结论 TCE可引起细胞免疫和体液免疫发生明显改变,说明TCE导致的免疫损伤属于细胞免疫和体液免疫共同参与的混合型变态反应,可能是Ⅳ型和Ⅱ型变态反应.
- 徐新云李学余刘月峰
- 关键词：三氯乙烯变态反应细胞免疫体液免疫
- 三氯乙烯对CYP2E1基因高表达细胞和正常肝细胞的毒性作用被引量：4
- 2014年
- 目的 应用分子克隆技术建立CYP2E1基因高表达细胞株,观察三氯乙烯（TCE）对CYP2E1基因高表达细胞和正常肝细胞的毒性,探讨CYP2E1基因在TCE毒性中的作用.方法 用不同剂量三氯乙烯（0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L）对CYP2E1高表达细胞和正常人肝细胞（L02细胞）进行染毒12h,观察凋亡基因（Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9）和癌基因（c-fos、c-myc、k-ras、p53）表达变化.结果 TCE染毒引起L02肝细胞和CYP2E1高表达细胞Bcl-2表达水平下降,0.25～2.0 mmol/L TCE剂量时L02肝细胞Bcl-2表达下降50％～60％,但相同剂量组的CYP2E1高表达细胞Bcl-2表达水平明显高于正常肝细胞20％～50％; 0.5～4.0 mmol/L TCE剂量时CYP2E1高表达细胞中凋亡基因caspase-3、caspase-8、caspase-9表达水平比正常肝细胞高30％～600％,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.TCE染毒后对L02肝细胞和CYP2E1高表达细胞的癌基因表达水平有明显差异,在0.5 ～4.0 mmol/L TCE染毒时,CYP2E1高表达细胞的c-fos、k-ras和c-myc基因表达水平明显高于L02肝细胞,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,升高幅度达25％～120％; CYP2E1高表达细胞的p53表达水平比正常肝细胞表达下降10％～50％,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.结论 TCE对正常肝细胞和CYP2E1高表达细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP2E1是TCE在体内代谢的重要因素,与TCE毒性存在一定关系.
- 徐新云毛侃琅袁建辉吴德生黄海燕秦逍云谭琴
- 关键词：三氯乙烯肝细胞细胞色素P-450
- CYP2E1基因RNA干扰载体的构建与表达被引量：4
- 2012年
- 目的:构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持。方法:通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLKO.1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果结果:PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLKO.1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1基因沉默细胞,荧光定量PCR检测shRNA3的最高抑制效率为86.9%,Western blot鉴定shRNA3基本无CYP2F1表达。结论:利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。
- 毛吉炎徐新云何晓阳毛侃琅黄海燕刘庆成
- 关键词：CYP2E1RNA干扰慢病毒
- 三氯乙烯对CYP1A2高表达肝细胞株凋亡基因和癌基因的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:构建CYP1A2基因高表达载体,转染到L02肝细胞,建立CYP1A2高表达细胞株并检测三氯乙烯对该细胞株凋亡基因和癌基因的影响。方法:根据GenBank提供的CYP1A2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到CYP1A2高表达L02细胞株,通过荧光定量PCR和Westernblot对细胞株进行鉴定。用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP1A2高表达细胞进行染毒12h,采用PCR方法检测凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)mRNA表达的变化。结果:测序证明重组慢病毒高表达载体CYP1A2基因序列与GenBank提供的CYP1A2序列一致,荧光定量PCR检测显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2mRNA表达比正常L02肝细胞提高317倍,Westernblot结果显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2蛋白表达水平比正常L02肝细胞高3.41倍。三氯乙烯染毒后,CYP1A2高表达细胞中凋亡基因Bcl-2mRNA表达水平与正常肝细胞无显著性差异(P>0.05),而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9mRNA表达水平高于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01)。CYP1A2高表达细胞中癌基因c-myc和p53mRNA表达水平低于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01),而c-fos和K-rasmRNA则高于正常肝细胞(P<0.05或P<0.01)。结论:三氯乙烯对CYP1A2高表达细胞凋亡基因和癌基因表达有显著影响,提示CYP1A2是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系。
- 毛侃琅徐新云毛吉炎袁建辉刘国红吴德生杨细飞周丽黄新凤
- 关键词：肝细胞CYP1A2慢病毒载体三氯乙烯凋亡基因癌基因
- CYP1A2基因沉默及其对三氯乙烯毒性影响被引量：4
- 2013年
- 目的构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称"L02细胞"),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响。方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞。筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定。分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12 h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmol/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化。结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA序列一致。CYP1A2沉默细胞的CYP1A2 mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9%和82.4%(P<0.01)。TCE染毒后,0.25～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P<0.01);部分0.25～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc、k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P<0.05或P<0.01)。结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用。
- 徐新云毛侃琅毛吉炎吴德生秦逍云杨细飞张然周丽黄新凤
- 关键词：三氯乙烯凋亡基因癌基因
- CYP1A2基因在三氯乙烯毒性中的作用研究
- 2013年
- [目的]应用分子克隆技术,建立CYP1A2基因沉默细胞株和CYP1A2基因高表达细胞株,研究CYP1A2基因对三氯乙烯毒性的影响。[方法]将三氯乙烯分别染毒L02肝细胞、CYP1A2基因沉默细胞和CYP1A2基因高表达细胞,染毒剂量分别为0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、2.00 mmol/L和4.00 mmol/L,以DMSO作为对照溶剂,染毒12 h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、k-ras、P53)表达水平。[结果]三氯乙烯染毒CYP1A2基因沉默细胞后,Bcl-2的mRNA表达水平高于对照组(P<0.01),三氯乙烯部分剂量组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和癌基因c-fos、c-myc表达水平低于对照组(P<0.05或P<0.01)。三氯乙烯染毒CYP1A2基因高表达细胞后,Bcl-2的mRNA表达水平相比对照组下降(P<0.01),Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达水平相比对照组升高(P<0.01);CYP1A2高表达细胞中癌基因c-fos、c-myc、k-ras表达水平高于对照组(P<0.01),P53表达水平低于对照组(P<0.01)。[结论]在体内代谢与CYP1A2存在密切关系,沉默CYP1A2基因可以减少三氯乙烯在肝细胞内代谢活化,导致三氯乙烯对凋亡基因和癌基因表达水平下降;三氯乙烯在CYP1A2基因高表达细胞中,表现出对凋亡基因和癌基因的促进表达作用。
- 徐新云毛侃琅彭朝琼吴德生周丽秦逍云谭琴
- 关键词：三氯乙烯CYP1A2凋亡基因癌基因
