山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(2006BS06010)
- 作品数：11 被引量：36H指数：4
- 相关作者：杨宏军王长法仲跻峰杨少华高运东更多>>
- 相关机构：山东省农业科学院新疆农业大学山东省海洋水产研究所更多>>
- 发文基金：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金山东省农业科学院青年科研基金山东省农业科学院高技术自主创新基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达
- 2009年
- 以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%。构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达。
- 杨钦王长法杨宏军杨少华高运东仲跻峰彭广能
- 关键词：金黄色葡萄球菌克隆
- 奶牛乳腺炎主要致病菌的分离与鉴定被引量：15
- 2008年
- 对山东省济南、泰安和临沂等地区5个奶牛场的160份乳样进行了临床型乳腺炎和隐性乳腺炎的判定检测,并进行了主要致病菌的分离鉴定。结果表明,160份乳样中有127份呈乳腺炎阳性,其中临床型乳腺炎占36.22%,隐性乳腺炎占63.78%;从这些乳样中分离到了主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌,金黄色葡萄球菌依据溶血型的不同主要有α溶血、β溶血、α+β溶血和不溶血四种;大肠杆菌依据O抗原诊断血清得出主要有O2、O21、O76和O88这四种型;无乳链球菌依据溶血型主要为β溶血型。
- 曹丙蕾赵宏坤王长法高运东杨少华杨宏军仲跻峰
- 关键词：奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌大肠杆菌无乳链球菌
- 牛源无乳链球菌CAMP因子(cfb)的克隆及原核表达被引量：1
- 2009年
- 提取能产生CAMP反应的牛源无乳链球菌山东分离株的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768 bp的ORF,可编码含255个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成相比,第8位Tyr→Cys,第95位Pro→Ser,第126位Thr→Ala的3个氨基酸发生了点突变,同源性为98.4%。成功构建原核表达载体pET32a+/cfb,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为48 kD,表达量占菌体总蛋白的52.7%。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
- 王向柳王长法杨宏军阿合买提·买买提高运东仲跻峰
- 关键词：无乳链球菌克隆
- 无乳链球菌CAMP因子(cfb)的克隆及原核表达质粒的构建被引量：1
- 2008年
- 提取无乳链球菌的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到PMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768bp的ORF,可编码含256个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成同源性为98.4%。挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32 a+/cfb。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
- 王向柳王长法杨少华杨宏军阿合买提.买买提高运东仲跻峰
- 关键词：无乳链球菌克隆
- 牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析被引量：4
- 2010年
- 本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。
- 高小艳王长法刘顺德李秋玲杨宏军杨少华仲跻峰何洪彬
- 关键词：抗菌活性乳腺炎
- 荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建被引量：3
- 2007年
- 根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。
- 刘双龙王长法杨宏军杨少华阿合买提.买买提高运东仲跻峰
- 关键词：Β-防御素荷斯坦牛
- 短蛸AFLP分子标记分析体系的优化与建立被引量：4
- 2010年
- 本研究构建了短蛸扩增片段长度多态性(AFLP)分析体系,对DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等步骤进行了分析。得到了一种适于短蛸AFLP技术分析的优化体系,该体系中各优化因素为:模板DNA浓度为200 ng/μL;酶切体系中,MseI和EcoR I各加入5 units,缓冲液使用MseI buffer Tango,反应时间为3-4 h;连接最适反应时间为12 h;预扩增产物最适稀释倍数为20倍。该体系的构建为AFLP技术在短蛸分子遗传多样性研究中的应用奠定了基础。
- 张龙岗杨建敏刘相全
- 关键词：AFLP短蛸反应体系优化
- 牛源金黄色葡萄球菌突变株的筛选、鉴定及其免疫原性的研究被引量：2
- 2010年
- 【目的】诱变牛源金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb),筛选、鉴定弱毒性突变株,并研究其在鼠上的免疫交叉保护性。【方法】牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb,经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)化学诱变,经生长特性、回复突变、毒力检测、LD50、多种特征性酶检测、小鼠中免疫保护性等实验比较研究了突变株与亲本株的生物学特性,筛选得到遗传性状稳定β-溶血素缺失的弱毒性突变株。【结果】弱毒性突变株Hx与亲本株相比:其β-溶血性状完全缺失,生长缓慢,耐热核酸酶、血浆凝固酶等胞外蛋白的产量减少,在活体条件下可产生荚膜,半数致死量(LD50)10-1.83.mL-1远低下于亲本株的10-4.33.mL-1。亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死量是未接种过的6—50倍。非亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死率是未接种过的5—60倍。【结论】突变株Hx的β-溶血素缺失,毒性减弱,对金黄色葡萄球菌攻击具有较高免疫保护性。
- 赫娜王长法杨宏军何洪彬杨少华王立群高运东仲跻峰
- 关键词：金黄色葡萄球菌MNNG突变株半数致死量
- 金葡菌荚膜多糖血清型的研究进展被引量：1
- 2007年
- 金葡菌是引起奶牛乳腺炎的一种主要的致病菌,致病性金葡菌多数含有荚膜成分,金葡菌荚膜多糖有11种血清型。从不同血清型荚膜多糖的结构,基因构成,抗吞噬作用,致病性等方面作了介绍,并简要介绍了金葡菌荚膜多糖血清型的国内外研究现状。
- 王英杰杨宏军王长法安利国
- 关键词：金葡菌荚膜多糖血清型
- 荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析被引量：4
- 2010年
- 【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05mg·mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。
- 武建明王长法何洪彬胡桂学杨宏军杨少华高运东仲跻峰
- 关键词：荷斯坦牛抗菌活性乳腺炎
