国家自然科学基金(30871572)
- 作品数：9 被引量：60H指数：5
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- 茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析被引量：7
- 2011年
- 采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因(TS)的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1 503 bp,开放阅读框(ORF)为1 071 bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39 250.3 Da,理论等电点(PI)为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。
- 李娟邓婷婷吴扬刘硕谦李勤刘仲华黄建安
- 关键词：全长CDNA克隆
- 毛细管电泳四色荧光检测法分析茶树SSR标记(英文)被引量：12
- 2009年
- 将毛细管电泳四色荧光检测技术应用于茶树SSR标记分析.该方法采用三引物PCR扩增SSR位点,三引物即在5′端加有M13尾巴序列(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′)的特异正向引物、特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物;为了运用四色荧光检测系统使通过一次毛细管电泳能同时检测3个以上的SSR位点,采用蓝、绿、黑3种不同颜色的荧光染料分别对3个M13引物进行标记.应用该方法对42个茶树品种(系)的16个SSR位点进行遗传分析的结果表明:此法具有简便、可靠、低成本及高通量的优点;且随着所分析SSR位点数的增加,降低成本的效果更加显著.采用建立的方法,还筛选获得了11个多态性丰富的可应用于茶树遗传研究的SSR标记.
- 黄建安李娟谭月萍刘硕谦李勤刘仲华
- 关键词：毛细管电泳茶树
- 配体交换色谱手性固定相法拆分与定量茶氨酸对映体被引量：3
- 2010年
- 本文建立了配体交换色谱手性固定相法拆分与定量茶氨酸对映体的方法。色谱条件为:L-羟基脯氨酸键合手性柱;0.8mmol/L的硫酸铜-水溶液为流动相;波长254nm;流速1.0mL/min;柱温30℃。L-茶氨酸的进样量在0.08126～4.5144μg范围内峰面积与进样量之间呈现良好线性关系,加标回收率为97.26%～102.1%,检测限为0.02742μg,定量限为0.06503μg;D-茶氨酸的进样量在0.08250～4.5832μg范围内峰面积与进样量之间线性关系良好,加标回收率在97.07%～101.2%,检测限为0.02941μg,定量限为0.06982μg。该方法具有良好的稳定性和准确度。
- 李银花李娟刘仲华黄建安
- 关键词：高效液相色谱
- 茶树蛋白质双向电泳样品制备技术研究被引量：14
- 2011年
- 为探索一种适用于茶树蛋白质双向电泳的样品制备方法,研究比较了TCA/丙酮沉淀法、改良的Tris-HCl抽提法,以及酚-甲醇/醋酸铵沉淀法3种植物蛋白质样品制备方法。结果表明,改良的Tris-HCl抽提法较适合于茶树蛋白质双向电泳的样品制备。该改良方法制备的茶树蛋白质样品经双向电泳分离,可获得1117±9.89个蛋白质点,其中大部分蛋白质的等电点集中在pI5～7之间,相对分子质量集中在15.00～95.00kD之间,背景清晰且蛋白质得率较高,能满足茶树蛋白质组学研究的需要。
- 李勤黄建安刘硕谦李娟刘仲华
- 关键词：茶树双向电泳蛋白质组学
- 茶树泛素活化酶基因全长cDNA克隆及序列分析被引量：8
- 2012年
- 应用cDNA-AFLP技术分离安吉白茶阶段性返白过程中的差异表达基因,获得一白期表达上调片断TDF(transcript derived fragment,TDF)。BLAST比对结果显示,该片段与其他物种的泛素活化酶基因有很高的相似性。通过SMART-RACE技术分别扩增出其3′和5′末端序列,成功获得该基因全长cDNA序列(GenBank登录号JN180299)。所得序列全长3 764 bp,其开放阅读框编码1 094个氨基酸,蛋白分子量约为121 kD。该基因的氨基酸序列与烟草、蓖麻、水稻、小麦、拟南芥中的UBA1基因编码的氨基酸序列分别有82%、81%、79%、79%、77%的同源性。qRT-PCR分析表明,安吉白茶UBA1基因在白化期的表达量是返绿期的2.49倍。泛素活化酶是泛素蛋白酶体介导的蛋白质降解系统中1个关键酶,茶树泛素活化酶基因的克隆为进一步研究安吉白茶阶段性白化的分子机理奠定了基础。
- 邓婷婷吴扬李娟李银花黄建安刘仲华
- 关键词：茶树CDNA克隆
- 黄金茶种质资源遗传多样性的AFLP分析被引量：4
- 2013年
- 应用AFLP-银染技术，分析黄金茶群体111个株系的遗传多样性与亲缘关系。选用多态性高、分辨力强的引物组合E37M32、E41M33与E41M42分别扩增样品基因组DNA，共得到229条清晰条带，其中多态性条带186条，多态位点百分比为81．22％，反映了样品基因组DNA具有较高的多态性。111个样品得出的平均有效等位基因数（Ne）为1．42~0．35，平均Nei’S基因多样性（H）为O．25＋0．18，平均Shannon’S信息指数（I）为0．38＋0．25。应用NTSYSpc2．1软件，计算得到111个样品间的相似系数在0．65～0．99之间，平均为0．76。根据UPGMA法，将111个株系分成8大类群，绘制样品AFLP聚类树状图。本研究为黄金茶种质资源的保护及利用，从分子水平提供了一定的依据。
- 吴扬邓婷婷李娟李银花刘硕谦王英姿黄建安刘仲华
- 关键词：AFLP
- 茶树cDNA-AFLP银染技术体系的建立被引量：2
- 2011年
- 为了挖掘安白茶白化期相关的差异基因,建立并优化了茶树叶片cDNA-AFLP扩增反应体系,进行cDNA-AFLP分析。在安吉白茶叶片cDNA-AFLP的试验中,分别对20μL预扩增和选择性扩增反应体系中的4种反应条件影响因子进行不同梯度优化的研究,包括引物、Mg2+、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量。PCR预扩增20μL反应体系中,引物75ng/20μL,Mg2+2.0mM,dNTP0.2mM,TaqDNA聚合酶1U时预扩增效果较好;PCR选择性扩增20μL反应体系中,引物75ng/20μL,Mg2+2.5mM,dNTP0.2mM,TaqDNA聚合酶1.5U时选择性扩增效果较好。通过试验,获得较为理想的预扩增和选择性扩增体系。
- 吴扬邓婷婷李娟欧秋良黄建安
- 关键词：茶树CDNA-AFLP银染
- 茶氨酸生物合成基因工程菌的构建及重组酶的表达被引量：4
- 2011年
- 将来源于Escherichia coli DH5α的γ-谷氨酰转肽酶基因克隆到高表达质粒pET-32α中,并转化E·coli BL21,构建茶氨酸生物合成的基因工程菌。工程菌在温度为20℃,OD600nm为1.5,IPTG浓度为0.1mmol/L,培养基初始pH为7的条件下,诱导培养6h,γ-谷氨酰转肽酶的酶活力达(4.41±0.17)U/mL,大约是出发菌株E·coli DH5α的18.4倍。直接以工程菌为催化剂,在200mmol/L谷氨酰胺、1.5mol/L乙胺盐酸盐、pH10、20℃的条件下,反应6h,茶氨酸合成量达12.6mg/mL,L-谷氨酰胺转化率为41.05%。
- 李勤黄建安李娟刘仲华
- 关键词：茶氨酸工程菌重组质粒重组酶
- ‘安吉白茶’抑制消减杂交cDNA文库的构建及初步分析被引量：7
- 2011年
- 应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分离‘安吉白茶’全白期与全绿期叶片差异表达基因,成功构建了‘安吉白茶’白期叶与绿期叶的正、反向消减文库。随机挑选80个阳性克隆测序,通过BLASTX比对分析,80个序列中有30个没有找到任何同源序列,8个序列太短,且同源性不高,42个序列与已知蛋白有着或高或低的同源性。其中有3个基因片段可能与‘安吉白茶’高氨基酸形成相关。
- 李娟刘硕谦刘仲华李勤吴扬邓婷婷黄建安
- 关键词：安吉白茶抑制消减杂交氨基酸差异表达基因
