河南省科技攻关计划(102102310154)
- 作品数：7 被引量：13H指数：4
- 相关作者：王明永王凡平孙瑞利郭庆合赵东方更多>>
- 相关机构：新乡医学院新乡医学院第一附属医院新乡医学院第三附属医院更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划河南省高校科技创新团队支持计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人TLR4胞外段的克隆、表达及功能活性分析被引量：2
- 2011年
- 目的:获得高纯度、高活性的人TLR4胞外段蛋白。方法:采用PCR方法从含人TLR4 cDNA的质粒pCDNA3-TLR4中扩增人TLR4胞外段基因片段,将其插入载体pET32a并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的相对分子质量和抗原性,ELISA和FCM鉴定其功能活性。结果:获得1 911 bp的人TLR4胞外段基因片段,构建成重组表达载体pET32a-TLR4并在大肠杆菌中表达。TLR4-Trx融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的12%,其纯度较高。ELISA和FCM检测显示,TLR4-TrX融合蛋白不仅与配体LPS结合,还能竞争性抑制LPS与THP1细胞结合。结论:所获TLR4-Trx融合蛋白纯度高,功能活性好,为进一步研究TLR相关的免疫调节机制提供物质基础。
- 王凡平王明永孙瑞利郭庆合张婧婧杨景瑞张新富段巨洪
- 关键词：基因克隆功能活性
- MBL抑制白假丝酵母菌刺激THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-8被引量：10
- 2011年
- 目的 探讨甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）对白假丝酵母菌（Candida albicans）刺激的THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-8的影响.方法 以不同浓度人MBL预处理THP1/CD14细胞2 h后,再用热灭活的酵母相C.albicans和/或菌丝相C. albicans刺激细胞24 h,收集培养上清,以ELISA从蛋白水平分析其TNF-α和IL-8的产生.收集细胞提取总RNA,以RT-PCR从转录水平评估TNF-α和IL-8的表达,Western blot分析NF-KB的细胞核移位.结果 ELISA检测发现,两种相态的C. albicans均可刺激各组细胞分泌TNF-α和IL-8,酵母相C.albicans刺激细胞产生细胞因子水平稍高;高浓度MBL（10～20 mg/L）均可抑制两种相态的C. albicans诱导细胞分泌TNF-α和IL-8,低浓度MBL（1 mg/L）则几乎无影响;RT-PCR分析亦显示,与相应只用C. albicans刺激的实验组相比,高浓度MBL（20 mg/L）对两种相态的C. albicans诱导的TNF-α、IL-B的mRNA表达均有不同程度的抑制作用;Western blot分析显示,高浓度MBL（20 mg/L）对两种相态的C. albicans诱导的NF-KB细胞核移位有显著的抑制作用.结论 MBL可抑制C.albicans诱导的THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-8,提示MBL能够在抗C.albicans 免疫中起调控作用.
- 王明永王凡平郭晓芳孙瑞利郭庆合张婧婧杨景瑞张新富段巨洪
- 关键词：甘露聚糖结合凝集素白假丝酵母菌细胞因子免疫调节
- 模式抗原Mannan-TTC的制备及免疫原性分析
- 2013年
- 目的:制备高免疫原性的模式抗原Mannan-TTC,分析其免疫原性。方法:将甘露聚糖(Mannan)与破伤风毒素C片段(TTC)蛋白进行化学交联,SDS-PAGE分析交联产物。用混合淋巴细胞反应检测DC负载Mannan-TTC刺激同种异体T细胞增殖的能力;WST-1和ELISA检测TTC特异性CD4+T细胞的增殖和分泌IFN-γ的能力;小鼠免疫后,用ELISA检测TTC特异性抗体水平。结果:成功交联Mannan与TTC,获得模式抗原Mannan-TTC。该交联产物能通过活化树突状细胞(DC),不仅增强了对同种异体T细胞增殖的能力,而且显著增强TTC抗原特异性的CD4+T淋巴细胞增殖及分泌细胞因子IFN-γ。动物免疫实验则显示,该交联产物能刺激小鼠免疫细胞产生TTC抗原特异性的抗体,但与单纯TTC抗原刺激相比,无显著性差异。结论:所获Mannan-TTC抗原免疫原性好,能显著增强细胞免疫应答,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原。
- 王凡平王明永赵东方马淑君余文发杜继英丁肖华朱琳琳谭静赵永新毛光兰申家辉
- 关键词：甘露聚糖免疫原性
- 甘露聚糖结合凝集素抑制肽聚糖刺激THP-1／CD14细胞产生的炎性反应及机制被引量：5
- 2012年
- 目的探讨甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin，MBL）对肽聚糖（peptidogly—can，PGN）刺激佛波酯（PMA）活化的THP-1／CD14细胞产生TNF—α和IL-6影响。方法用PMA活化THP-1／CD14细胞，以不同浓度人MBL预处理2b后再用PGN刺激24h。收集培养上清，以ELISA从蛋白水平分析TNF-α和IL-6的产生。收集细胞提取总RNA，以RT—PCR从转录水平评估TNF—α和IL-6的表达。FACS分析MBL与THP-1／CD14细胞的结合，并进一步分析MBL对PGN结合THP-1／CD14细胞的影响，Western blot分析NF-κB的细胞核移位。结果ELISA检测发现，PGN可刺激PMA活化的各THP-1／CD14细胞分泌TNF-α和IL-6，高浓度MBL（10～20mg／L）可抑制PGN诱导细胞分泌TNF—α和IL-6；RT—PCR分析亦显示，MBL（20mg／L）对PGN诱导的TNF—α和IL-6的mRNA表达有不同程度的抑制作用；流式细胞术检测显示MBL能够与THP-1／CD14细胞以Ca^2＋依赖形式结合，PGN可竞争性抑制MBL结合THP-1／CD14细胞。MBL还可通过结合THP-1／CD14竞争性抑制PGN与THP-1／CD14的结合。Western blot分析显示，MBL对PGN诱导的NF—κB细胞核移位有显著的抑制作用。结论MBL通过配体结合抑制PGN诱导的THP-1／CD14细胞产生的细胞反应，提示MBL能够在PGN诱导的炎性反应中起免疫调控作用。
- 王凡平王明永杨建斌赵东方连荣徐素玲邵峰孙瑞利郭庆合李海斌郭继强宋志善
- 关键词：甘露聚糖结合凝集素肽聚糖THP-1
- 甘露聚糖结合凝集素诱导DC成熟机制分析被引量：6
- 2012年
- 目的:探讨甘露聚糖结合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)诱导人外周血单核细胞(Mo)来源树突状细胞(DC)成熟的机制。方法:从健康成人外周血分离Mo,常规方法体外诱导未成熟DC(imDC),FACS分析DC成熟过程中MBL对CD分子表达的影响,进一步分析MBL与imDC的结合情况;RT-PCR分析DC表面模式识别分子Toll样受体-2(TLR2)和Toll样受体-4(TLR4)的表达;凝胶电泳迁移率法(EMSA)和Western blot分析NF-κB的活性及细胞核移位。结果:FCM分析表明,MBL能够使DC表面CD83、CD86及MHC分子表达升高;MBL能够以Ca2+浓度依赖关系与imDC细胞结合;RT-PCR结果表明MBL能够减少DC表面TLR2和TLR4的表达。EMSA和Western blot分析结果显示,MBL能够增强NF-κB活性及细胞核移位。结论:MBL可通过直接结合imDC表面分子来影响DC模式识别分子的表达并调节信号分子NF-κB活性,提示MBL能够通过配体结合调控DC分化成熟,揭示了MBL调节DC分化成熟有关信号途径。
- 王凡平王明永杨建斌赵东方王红坡邵峰孙瑞利郭庆合凌明智赵永新宋士军郭继强
- 关键词：甘露聚糖结合凝集素树突状细胞TOLL样受体NF-ΚB免疫调节
- 幽门螺杆菌热休克蛋白A核酸疫苗的构建
- 2013年
- 目的构建幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位核酸疫苗,为进一步研制Hp核酸多价疫苗提供技术平台。方法以PMD-HspA为模板,扩增、纯化Hp hspA基因,插入到真核表达载体PcDNA3中,转化大肠埃希菌DH5a,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,得到重组核酸疫苗pcDNA3-HspA,用特异性PCR方法和小提质粒酶切电泳鉴定重组质粒,同时将pcDNA3-HspA进行测序,进一步确定是否构建成功及鉴定构建过程中是否发生基因突变。结果 PCR鉴定结果显示,扩增产物为0.36kb的目的基因;酶切鉴定结果显示,得到5.45kb克隆载体片段和0.36kb的目的基因片段;重组质粒pcDNA3-HspA测序,得到基因全长357bp目的基因片段,与克隆质粒测序图比较,无基因变异。结论成功构建了Hp单价核酸疫苗pcDNA3-HspA,为研制Hp核酸多价疫苗奠定基础。
- 王凡平王明永杨建斌赵东方孙瑞利余文发郭庆合马淑君朱琳琳赵永新谭静
- 关键词：幽门螺杆菌核酸疫苗
- MBL抑制LPS诱导DC成熟机制的研究被引量：8
- 2013年
- 本研究探讨甘露聚糖结合凝集素(MBL)对细菌脂多糖(LPS)诱导的人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)成熟的机制。从健康成人外周血分离单核细胞(Mo),用常规方法体外诱导未成熟DC(imDC),FACS分析MBL与imDC的结合,并进一步分析MBL对LPS结合imDC的影响;ELISA和Western blot分析MBL与可溶性的TLR4胞外段蛋白(sTLR4)结合;Western blot分析NF-κB的细胞核移位。结果表明,在钙离子存在下,MBL能够直接与imDC结合,sTLR4和LPS可竞争性抑制MBL与imDC的结合。Western blot与ELISA分析结果显示,MBL能够以浓度依赖的方式结合sTLR4蛋白。FACS分析结果进一步表明,MBL通过结合imDC竞争性抑制LPS与imDC的结合。Western blot分析结果亦显示,MBL对LPS诱导的NF-κB细胞核移位有显著的抑制作用。结论:MBL可通过结合表达在imDC的TLR4分子竞争性抑制LPS结合imDC,从而抑制LPS诱导imDC成熟,提示MBL能够通过配体结合调控DC分化成熟。本研究为阐明MBL抑制LPS诱导DC成熟的机制提供了较好的实验依据。
- 王凡平王明永郭晓芳石如玲徐素玲马淑君李海斌郭继强杨秀丽
- 关键词：甘露聚糖结合凝集素细菌脂多糖树突状细胞TOLL样受体-4
