宁夏回族自治区自然科学基金(NZ03680)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
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- 大鼠NRF-1基因的克隆、鉴定及功能分析
- 2014年
- 目的克隆大鼠NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,了解NRF-1基本结构和蛋白分子特征,预测可能的相关作用蛋白分子,为下一步研究NRF-1对心衰细胞能量代谢途径的作用机制提供实验材料和依据。方法通过重叠延伸PCR(SOE PCR)的方法合成目的基因序列,连接于载体pMD18-T,然后转化至感受态大肠杆菌DH5α。PCR及测序鉴定重组质粒NRF-1/pMD18-T序列正确性。并通过生物信息学软件分析NRF-1的氨基酸序列,蛋白质二级结构,修饰位点及蛋白质之间作用关系等,进行预测。结果大肠杆菌DH5α中保存的重组质粒NRF-1/pMD18-T经测序鉴定,其中的NRF-1基因序列与原始序列一致。生物信息学分析表明NRF-1的蛋白质分子量为57.28kD,分子式为C2498H3976N704O808S15,等电点为5.28,是稳定的亲水蛋白,α-螺旋和β-折叠结构较多,NRF-1与mtTFA,Akt1和Spastin等多个蛋白关系密切。结论本研究成功地克隆了NRF-1基因并重组于载体pMD18-T,为后续研究NRF-1对心衰心肌细胞能量代谢的调控机制提供了实验材料和研究思路。
- 王程铖宋熔李君良王玉姣王强赵巍
- 关键词：克隆
- NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达被引量：3
- 2014年
- 目的:构建核呼吸因子-1(NRF-1)基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1)后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)。方法:利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6.3-NRF1-IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1),然后用杀稻瘟素(blasticidin)筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果:收集的重组慢病毒滴度为5.5×107TU/ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2.25倍。结论:本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2(2-1)中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。
- 宋熔王程铖王强王玉姣李君良赵巍
- 关键词：慢病毒表达载体心力衰竭
