国家自然科学基金(31060013)
- 作品数：9 被引量：57H指数：5
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- 青海湖嗜盐菌的分离与优势菌株QHL5的特性被引量：10
- 2012年
- 采用高盐选择性培养基从20份青海湖水样中筛选分离获得35株青海湖嗜盐微生物.耐盐梯度实验分析表明:水体中以中度嗜盐菌为主,约占65.7%;弱嗜盐菌次之,约占25.7%;非嗜盐菌与耐盐菌相对较少,约占8.5%.其中优势菌QHL5的生长盐度耐受范围为0.04～3.0 mol/L,最适生长范围为0.3～0.9 mol/L,隶属于中度嗜盐菌.菌体形态和生长特性分析表明:QHL5菌落大小为4～6 mm,圆形或椭圆形,边缘整齐厚实,乳白色,中间微隆起,不透明,革兰氏染色阴性.显微形态呈杆状,最适生长pH为8.5～9.5,最适生长温度为35℃.生理生化、16S rRNA的全序列Blast和系统发育分析表明:QHL5菌株分类定位于γ变形菌纲海洋螺菌目盐单胞菌属樊氏盐单胞菌(Halomonas ventosae).通过80%乙醇法抽提胞内相溶物质,采用TLC法检测出该菌积聚四氢嘧啶.
- 朱德锐刘建刘静静沈国平龙启福高翔刘德立
- 关键词：中度嗜盐菌TLC法四氢嘧啶
- 青海湖盐单胞菌Ectoine合成基因簇ectABC的重组共表达被引量：5
- 2015年
- 盐单胞菌属(Halomonas)通过胞内积聚有机相容溶质(Compatible solutes)来抵抗胞外的高盐渗透压。为了探究相容溶质Ectoine合成代谢相关基因的结构特征和异源共表达的可能性,以青海湖盐单胞菌Halomonas sp.QHL1为材料,通过高效液相色谱(HPLC)分析不同盐梯度下QHL1胞内Ectoine的积聚量,并借助于染色体步移技术(Genome walking)捕获QHL1菌株的Ectoine生物合成基因簇ect ABC,利用分子克隆技术分析ect ABC基因簇的异源重组表达(E.coli BL21)。研究结果表明:胞内Ectoine的积聚量随着培养基中Na+浓度的增加而增加,最大积聚量为167.1 mg/g细胞干重(1.0 mol/L Na+),但菌体生长却受到高浓度Na+的强烈抑制作用。QHL1的ect ABC操纵子全长序列为3580 bp,结构基因ect A(579 bp)、ect B(1269 bp)与ect C(390 bp)串联排列。基于生物信息学预测分析,两个启动子(δ70与δ38因子控制)和若干未知功能的保守模序(Motifs)存在于QHL1的ect操纵子上游。构建重组表达载体p ET-28-ect ABC,并在E.coli BL21中异源表达ect ABC基因簇(2438 bp)。SDS-PAGE结果显示Ect A、Ect B和Ect C分别为27.2、52.5和20.8 k D,与预测结果一致,表明ect A、ect B和ect C基因能在E.coli BL21中实现异源共表达,为构建Ectoine合成代谢基因整合的系统代谢工程,并实现低盐发酵控制和过量化生产提供了重要的理论基础。
- 朱德锐韩睿沈国平龙启福李丹丹刘建刘德立
- 关键词：盐单胞菌属ECTOINEECT结构基因共表达
- 嗜盐菌相溶物质合成与转运调节机制被引量：13
- 2011年
- 嗜盐菌是极端环境微生物的重要类群之一,作为新型微生物资源,为微生物生理、遗传分类及生命科学和相关学科许多领域的研究提供新的课题。文章综述了嗜盐菌的嗜盐渗透压分子调节机理中,相溶物质胞外吸收转运与胞内生物合成途径涉及的结构基因、主要酶类的相关研究进展,并对后续研究进行讨论与展望。
- 龙启福朱德锐韩睿芦殿香
- 关键词：嗜盐菌渗透压调节耐盐基因
- 一株积聚四氢嘧啶的青海湖盐单胞菌的分离及特性被引量：4
- 2012年
- 从青海湖采集20份水样，利用RM高盐培养基分离获得35株嗜盐菌．选取其中一株优势中度嗜盐菌QHL25进行形态学和生理生化特征分析，结果表明：QHL25菌落圆形或椭圆形，乳白色，不透明，中心突出，边缘透明，生长盐度为0~2．9mol／L，最适生长盐度为1．45mol／L．显微形态呈短杆状，革兰氏染色呈阴性，单个或成串排列．最适生长pH为8．5，最适生长温度为37℃．16SrDNA序列分析表明：该菌株与盐单胞菌属（Halomonassp．）相似性为98％；结合形态特征和生理生化特征分析，初步认定该菌株隶属于y变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）海洋螺菌目（Oceanospirillales）盐单胞菌科（Holomonadaceae）盐单胞菌属（Holomonas）．薄层层析（TLC）定性分析可知QHL25胞内含有相容溶质四氢嘧啶；高效液相色谱（HPLC）定量分析表明，在1．7mot／L的NaCl度下，四氢嘧啶含量约为36．70mg儋（细胞干重）．
- 刘建李丹丹杨芳芮昊晨沈国平刘德立朱德锐
- 关键词：盐单胞菌四氢嘧啶
- 10株青海湖盐单胞属菌株种间分子多样性分析被引量：1
- 2012年
- 目的对青海湖盐单胞属菌株进行种间分子多样性分析。方法利用PCR扩增青海湖10株盐单胞菌16S rDNA序列和16S-23S间隔序列,通过测序、Blast对比以及RFLP方法分析10株青海湖盐单胞菌的序列差异;并结合SDS-PAGE技术方法研究其全菌体蛋白的种间差异。结果通过测定16S rDNA序列同源性、分析16S-23S rDNA ISR多态性和比较全菌体蛋白SDS-PAGE谱带,确定了10株青海湖盐单胞菌在种间具有相对的一致性。结论初步验证了分子表型特性的多相研究对种单元初分类具有重要意义。
- 龙启福刘建韩睿沈国平朱德锐耿排力
- 关键词：盐单胞菌属RDNAPCR-RFLP16S-23S
- 青海湖嗜盐微生物系统发育与种群多样性被引量：27
- 2012年
- 青海湖是我国境内最大的内陆咸水湖泊,水体中嗜盐微生物的生存现状尚不明确。本研究利用OSM培养基(Oesterhelt-Stoeckenius medium),从湖域生境水样中富集和分离获得嗜盐微生物35株,以中度嗜盐菌为主,约占62.9%(22株);轻度嗜盐菌次之,约占22.9%(8株);耐盐菌与非嗜盐菌分别占11.4%(4株)和2.9%(1株)。根据16SrDNA序列的系统发育分析表明,γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)菌株最多,约占68.6%(24株);芽孢杆菌纲次之,约占17.1%(6株);放线菌纲、α-变形菌纲(α-Proteobacteria,1株)和散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae,1株)的类群相对较少。这些嗜盐菌属于14个属,其中以海洋螺菌目盐单胞菌属(Halomonas)为优势种群,共计10株;其次为海单胞菌属(Marinomonas),共4株。中度嗜盐菌盐单胞菌属应为青海湖嗜盐菌的优势种群,可能因为相对偏低的盐度环境,为其长期进化和适应性生存提供了必要条件。
- 朱德锐刘建韩睿沈国平杨芳龙启福刘德立
- 关键词：嗜盐微生物系统发育种群多样性
- 青海湖樊氏盐单胞菌QHL5四氢嘧啶合成影响因素分析被引量：4
- 2015年
- 以青海湖野生菌株Halomonas ventosae QHL5为材料,初步探讨了多种因素对胞内相容溶质四氢嘧啶(Ectoine)合成的影响.通过设置OSM培养基(Oesterhelt-Stoeckenius medium)的不同单因素诱导条件(Na+、K+、Mg2+、p H和温度等),培养QHL5菌株,并采用80%乙醇抽提QHL5胞内四氢嘧啶,进行高效液相色谱(HPLC)定量检测.结果表明,QHL5胞内四氢嘧啶积聚的最佳单因素培养条件为Na+浓度为1.5 mol·L-1,K+浓度为0.75 mol·L-1,Mg2+浓度为0.2 mol·L-1,p H 8.0和35℃.在优化条件下,QHL5积聚的四氢嘧啶最大浓度为379.6±8.26 mg·L-1,达到167.1±3.64 mg·g-1细胞干重.QHL5胞内的四氢嘧啶合成受到Na+的渗透刺激作用,生物量却受到高浓度Na+的抑制,低浓度Mg2+(0.1—0.6 mol·L-1)和中浓度的K+(0.5—1.2 mol·L-1)对四氢嘧啶的生物合成具有重要的渗透刺激作用.与已报道的四氢嘧啶合成菌株相比,QHL5能合成单一的、高浓度的四氢嘧啶,具备潜在的商业制备和应用开发价值.
- 朱德锐龙启福沈国平李丹丹刘德立
- 关键词：四氢嘧啶影响因素
- 青海湖嗜盐微生物筛选分离与生长特性被引量：5
- 2012年
- 为全面获得青海湖嗜盐菌种质资源,构建种群系统发育树和确定种群进化定位.采用高盐选择性培养基筛选,分离从20份青海湖水样中获得35株青海湖嗜盐微生物.耐盐梯度实验表明:水体中以中度嗜盐菌为主,约占62.85%,轻度嗜盐菌约占22.85%,非嗜盐菌与耐盐菌约占14.28%.青海湖中度嗜盐微生物能在10～45℃,pH 5.5～11.0的范围内生长,与地区盐碱化环境相关,具有嗜盐兼嗜碱微生物的特性.
- 沈国平朱德锐刘建韩睿龙启福
- 关键词：嗜盐菌
- 青海湖盐单胞菌QHL1 ectABC基因簇克隆鉴定及二氨基丁酸转氨酶基因ectB的异源表达
- 2013年
- 从青海湖20份水样筛选得到一株优势中度嗜盐菌QHL1,经初步鉴定为盐单胞菌属。设计保守基因ectB的引物,以基因组DNA为模板,PCR扩增获得ectB基因(1269 bp)。利用染色体步移技术,克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC及其上下游调控序列。DNAStar软件分析表明ectA、ectB和ectC位于同一个操纵子上,大小分别为579 bp、1269 bp和390 bp,预测分别编码192、422和129个氨基酸的肽链。同源性分析表明:Halomonas sp.QHL1ectABC基因簇所编码的二氨基丁酸转乙酰基酶(EctA)、二氨基丁酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合成酶(EctC)与Halomonas sp.Nj223 ectABC基因簇所编码的酶蛋白相似性分别达57%、96%和85%。利用分子克隆技术构建二氨基丁酸转氨酶基因ectB的重组表达载体pET-28-ectB,通过限制性内切酶酶切和测序分析,结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确。诱导表达重组菌,SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约46 kDa。
- 刘建朱德锐李逸李丹丹李耀东刘德立
- 关键词：四氢嘧啶染色体步移克隆表达
