国家科技重大专项(2003AA2Z3C64)
- 作品数：9 被引量：23H指数：3
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- 幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究被引量：1
- 2006年
- 目的构建幽门螺杆菌(helicobacterpylori,Hp)中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labileenterotoxinBsubunit,LTB)的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过口服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA-ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E.coliBL21(DE3),进行原核表达,重组表达蛋白采用HK26/60Superdex-75分子筛和亲和层析柱ChelatingSepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westernblot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb/c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25%,Tris-Tricine初步测定目的蛋白的Mr约59000,纯化后纯度大于90%。Westernblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。
- 高原张卫军邹全明
- 关键词：幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白疫苗
- 幽门螺杆菌外膜蛋白18的克隆表达及纯化研究被引量：1
- 2008年
- 目的克隆表达幽门螺杆菌(HP)外膜蛋白,为HP的疫苗开发及诊断试剂盒的研究奠定基础。方法用PCR方法从HP临床分离株9806的染色体DNA中扩增出OMP18基因片段,将目的基因插入表达载体pQE30中,重组载体pQE30-OMP18经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.M15,IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定其表达。结果PCR扩增出长度为537bp的OMP18基因,片段测序分析其与Gen-Bank公布的核苷酸序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,重组工程菌经IPTG诱导表达了分子量为20.0kDa的目的蛋白,占总蛋白的20%,经纯化后,目的蛋白纯度达85%以上;Western blot结果表明,该蛋白可与兔抗HP的多克隆抗血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论成功构建了OMP18表达载体pQE30-OMP18,并在大肠杆菌中获得高效表达,为HP疫苗有效抗原筛选及诊断试剂的开发奠定基础。
- 葛迪郭刚毛旭虎张卫军邹全明
- 关键词：幽门螺杆菌克隆
- Hp中性粒细胞激活蛋白研究进展被引量：1
- 2006年
- 幽门螺杆菌(Hp)是一种参与多种胃、十二指肠疾病的重要人类病原体,可引起慢性胃炎和消化性溃疡,并与胃癌密切相关。人类幽门螺杆菌感染的特征是胃黏膜炎症部位中性粒细胞持续浸润。幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(H.py-lorineutrophil-activating protein,HP-NAP)正是由于其能活化中性粒细胞而被如此命名。HP-NAP不仅是重要的毒力因子,而且是主要的候选疫苗抗原。本文综述了HP-NAP的结构、生物学活性和致病机制等的研究进展,并对其应用前景进行了展望。
- 高原邹全明
- 关键词：抗原
- 幽门螺杆菌双亚单位表位疫苗的构建及免疫原性研究被引量：5
- 2008年
- 目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)双亚基多表位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法设计引物采用PCR法将黏附素(HpaA)的一个B细胞表位与尿素酶B亚单位的三个TH表位及一个B细胞表位串联起来(HUepi),表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白采用阳离子和疏水层析进行纯化,经鉴定后皮下免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果PCR法扩增出了约233bp的目的片段;原核表达质粒pET-22b(+)-HUepi经酶切及测序鉴定,目的基因序列与设计序列一致;重组蛋白HUepi表达率约20.0%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约8.38×103Dr,破菌后电泳证实目的蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度大于97.6%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,TH表位多肽、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI>2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论Hp HpaA、UreB双亚基表位疫苗HUepi经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫原性。为新一代Hp疫苗的研制奠定实验基础。
- 周维英吴超石云邹全明
- 关键词：表位疫苗
- 幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定被引量：5
- 2007年
- 目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(HUepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(HUepi-LTB),并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR技术分别扩增HpaA-UreB表位多肽编码基因HUepi和LTB的编码基因LtB,重叠延伸PCR将2段基因拼接起来,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,采用阳离子和阴离子交换层析进行纯化,PAGE检测、N端测序和westernblotting、ELISA检测、GM1活性检测。结果成功构建表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白的高效表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,重组工程菌pET-22b(+)-HUepi-LtB/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20.7×103,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达97%,免疫学鉴定该融合蛋白与兔抗LTB抗血清可以发生特异性的结合。结论HpHpaA-UreB表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白(HUepi-LTB)经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性。为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。
- 周维英吴超石云张卫军邹全明
- 关键词：幽门螺杆菌黏附素尿素酶B亚单位
- 幽门螺杆菌适应性定植蒙古沙鼠前、后的蛋白质组学研究被引量：5
- 2007年
- 为比较研究幽门螺杆菌(Hp)适应性定植蒙古沙鼠前后的蛋白表达谱变化,将Hp临床分离株感染沙鼠,并体内连续传代,驯化一株高适应性菌株,然后采用双向电泳和质谱技术对适应性变化前后两株菌的差异蛋白进行鉴定。结果表明,随着Hp临床株在沙鼠体内的连续传代,感染率逐渐升高,第10代后,感染率稳定在90%以上。适应性定植后,Hp蛋白谱发生了变化。在选择的5个候选差异蛋白点中,共鉴定出4个蛋白,分别为Hp菌的功能未知的HP0318编码蛋白、氢化酶表达/形成蛋白(hypB)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、ADP-L-D-甘露庚糖表异构酶(rfaD)。上述鉴定蛋白可能与Hp适应性定植具有很大的相关性。
- 郭刚童文德曾浩刘开云邹全明
- 关键词：幽门螺杆菌双向电泳
- 幽门螺杆菌napA基因克隆及高效表达与鉴定被引量：1
- 2006年
- 高原邹全明吴超
- 关键词：幽门螺杆菌基因克隆中性粒细胞激活蛋白慢性活动性胃炎胃黏膜炎症
- 幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化被引量：2
- 2008年
- 目的克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul)。方法采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414-ltB(AUL)。融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白。结果PCR扩增出1350bp的目的基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2+-NTA树脂提纯。纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上。Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性。结论成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性。
- 张卫军郭刚刘开云解庆华邹全明
- 关键词：幽门螺杆菌融合蛋白
- 幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定被引量：3
- 2007年
- 目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出206bp和336bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致。重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Westernblot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论HpUreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。
- 周维英吴超石云邹全明
- 关键词：幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位疫苗
