湖北省自然科学基金(2006ABD007)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 相关作者：孙平章晓联曾洁陈芳潘勤更多>>
- 相关机构：武汉大学咸宁学院更多>>
- 发文基金：湖北省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Ficolin-A的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定
- 2008年
- 目的:克隆小鼠ficolin-A(mouse ficolin-A)基因,构建在真核及原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白,并制备其抗体,以进一步用于研究小鼠ficolin-A的功能。方法:用RT-PCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolin-A cDNA片段,并将该片段分别插入pVAX-1真核表达载体及pGEX-KG原核表达载体中,实现插入基因的融合,在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达。用GST-Sepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。制备ficolin-A的多克隆抗体并对其效价进行测定。结果:成功地构建了pVAX-1-ficolin-A真核表达载体及pGEX-KG-ficolin-A原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。并且成功制备了多克隆抗体。结论:成功地构建了重组表达载体pVAX-1-ficolin-A及pGEX-KG-ficolin-A,并在E.coliBL21中表达了ficolin-A蛋白,为下一步研究小鼠ficolin-A的功能奠定了基础。
- 周菁孙平章晓联
- 关键词：基因克隆蛋白表达抗体
- 人DC-SIGN的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化和鉴定
- 2008年
- 目的:获得纯化的DC-SIGN蛋白,为揭示DC-SIGN参与抗原提呈的机制,探讨宿主细胞DC-SIGN蛋白和HIV、HCV、结核杆菌等病原体的相互作用机制奠定基础。方法:人DC-SIGN的cDNA克隆到pGEX-KG表达载体上,转化入E.coli中,通过IPTG诱导,过度表达GST-DC-SIGN融合蛋白,并使用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱提取得到纯化的DC-SIGN蛋白,最后通过SDS-PAGE和Western Blot方法进行检测和鉴定。结果:酶切鉴定证实DC-SIGN基因已插入原核表达载体pGEX-KG。重组表达质粒pGEX-KG-DC-SIGN在大肠杆菌BL21中成功表达了DC-SIGN融合蛋白,其分子质量约为44 kU。结论:成功构建DC-SIGN原核表达重组质粒,并提取纯化出DC-SIGN原核蛋白,为下一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。
- 曾洁周从良孙平曹晓春章晓联
- 关键词：WESTERNBLOT
- DC-SIGN特异性适配子的筛选及鉴定被引量：3
- 2008年
- 目的:筛选高特异性、高亲合力结合DC-SIGN的单链DNA适配子,为开发抗HIV、HCV和结核杆菌感染的新型预防和治疗试剂奠定基础。方法:采用基于细胞表面展示的SELEX技术(TECS-SELEX),筛选出具有高亲合力结合DC-SIGN的单链DNA(ssDNA)适配子;运用流式细胞术(FCM)检测该适配子的亲合力;对最高亲合力适配子库进行克隆和测序;ELISA和FCM方法检测单适配子ZD8与DC-SIGN蛋白结合的剂量相关性;MTT法测定IC50观察适配子对细胞的毒性。结果:第14轮筛选的适配子库亲和力最高;DC-SIGN抗体能抑制适配子结合表达DC-SIGN蛋白的细胞;第14轮库中筛选的单适配子ZD8与DC-SIGN蛋白的结合率呈剂量依赖性;所筛选的单适配子对肝细胞几乎无毒性。结论:成功筛选出DC-SIGN蛋白的ssDNA适配子,为防治HIV、HCV和结核杆菌感染等DC-SIGN相关性疾病,提供新型预防和治疗的候选试剂和小分子药物。
- 陈芳曾洁孙平潘勤章晓联
- 关键词：DC-SIGN适配子
