广东省自然科学基金(37788)
- 作品数：12 被引量：74H指数：5
- 相关作者：许丽艳李恩民蔡唯佳沈忠英牛永东更多>>
- 相关机构：汕头大学北京工业大学广东医学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学自动化与计算机技术更多>>
- NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的研究被引量：2
- 2008年
- 以往研究发现, 食管癌细胞的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)基因的过表达具有明显的 12-O- 十四烷酰佛波醇 -13- 醋酸酯(12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate, TPA)诱导性, 在启动子- 152～- 60 区段存在着一种新型的 TPA 反应元件(TPA response element, TRE), 但是该元件的结合蛋白尚未被鉴定出来. 采用寡核苷酸 DNA 亲和层析法(oligonucleotide trapping)从食管癌细胞中分离纯化了 NGAL 基因 TRE 结合蛋白; 经 SDS-PAGE进一步分离, 银染显示目标蛋白带. 人工切取各目标蛋白带进行 MALDI-TOF-MS 分析, 通过 Mascot 软件搜索 NCBI 数据库, 根据蛋白质的功能、细胞定位和分子质量大小等指标确定 8 个核蛋白因子: C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β、FAM54A、KLF15、KLF10 和 YY-1. 最后, 利用 RT-PCR 验证了这些核蛋白因子表达的 TPA 反应性, 结果表明 C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β和 KLF15 等编码基因的转录表现出了明显的 TPA 反应性, 提示可能是食管癌细胞中应答 TPA刺激, 参与 NGAL 基因过表达的转录激活因子.
- 孟令英缪成贵杜则澎蔡唯佳许丽艳李恩民
- 关键词：NGAL基因MALDI-TOF-MS
- NGAL基因不同长度片段的克隆及其顺式作用元件定位分析被引量：4
- 2005年
- NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)是lipocalin家族的一个新成员,可能是人类的一种新癌基因,但其在肿瘤中的表达调控机制尚不清楚。应用生物信息学手段对NGAL(X99133,包括外显子和内含子)进行分析发现,此区域内含有许多潜在的顺式作用元件,其中主要为增强子元件。对此设计了以下实验:应用PCR技术从食管癌细胞SHEEC基因组DNA中扩增不同长度的NGAL基因片段,将其连接到PGEMT-eacy载体中进行扩增,并测序。NCBI/BLAST分析确认扩增片段为NGAL基因所有,与实验所设计相吻合。在此基础上并应用KEGG/MOTIF检索分析系统对NGAL基因的上述区段进行了顺式作用元件定位分析,结果共鉴定出5个Score值=100分的顺式作用元件位点。这为NGAL基因增强子的鉴定提供了新线索。
- 邱文冰许丽艳丘碧波黄丽娜吴梦峰李恩民
- 关键词：顺式作用元件NGAL基因克隆MOTIF扩增片段NCBI
- Fascin 1基因在永生化食管上皮细胞癌变中的表达被引量：27
- 2004年
- 背景与目的:Fascin1蛋白为一种与F-肌动蛋白结合的55kDa细胞骨架蛋白,从人畸胎瘤中克隆fascin1基因。食管上皮细胞癌变机制至今不甚明了,为此,对永生化食管上皮细胞株SHEE(Shantouhumanembryonicesophagealepithelialcellline)和由SHEE恶性转化而来的食管癌细胞株SHEEmt之间的差异表达基因在蛋白质和mRNA两个水平上进行检测分析,以期为揭示食管鳞状上皮细胞癌变机制提供新思路。方法:采用双向凝胶电泳技术分析SHEE与SHEEmt之间的蛋白质差异表达情况,以基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflyingmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)对部分差异表达蛋白质点进行鉴定,以逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionploymerasechainreaction,RT-PCR)对目标基因进行mRNA转录水平上的检测,并对RT-PCR产物进行序列测定分析。结果:在SHEE向SHEEmt的恶性转化中有9个基因出现差异表达,其中fascin1基因在蛋白质水平升高3.64倍,mRNA水平升高16.17倍。结论:fascin1基因可能与SHEE向SHEEmt的恶性转化有关。
- 荣举许丽艳蔡唯佳熊兴东李劲涛方王楷沈忠英李恩民
- 关键词：基因表达食管肿瘤
- NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定被引量：6
- 2004年
- 背景与目的:构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5’侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431-+84)。PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic。重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定。结果:成功构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-G0-G6。结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5’侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件。
- 许丽艳李恩民蔡唯佳沈忠英曾毅
- 关键词：NGAL基因基因表达调控荧光素酶报告基因
- 新候选癌基因STRBP8在人永生化食管上皮细胞癌变过程中差异表达的分析被引量：7
- 2005年
- 背景与目的:近年来,核基质蛋白(nuclearmatrixproteins,NMPs)成分、结构与功能改变在肿瘤发生发展过程中的作用已成为人们研究的热点问题。分离并鉴定肿瘤相关的NMPs,是寻找肿瘤特异性标志物并进一步研究肿瘤发病机制的一个新途径。本研究通过检测类视网膜母细胞瘤结合蛋白8(similartoretinoblastomabindingprotein8,STRBP8)在人永生化食管上皮细胞癌变过程中的差异表达,为寻找食管癌特异性标志物和研究食管癌的发病机制提供新线索。方法:硫酸铵沉淀法提取人胚永生化食管上皮细胞系SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞系SHEEC的NMPs,利用双向电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI鄄TOF鄄MS)和RT鄄PCR等技术检测STRBP8在SHEE和SHEEC中的差异表达。将STRBP8cDNA序列连接到pGEM鄄Teasy载体后,转化TOP10F蒺大肠杆菌感受态细胞,经筛选获得含STRBP8的阳性克隆,DNA序列测定后进行BLAST比对。结果:通过双向电泳和MALDI鄄TOF鄄MS技术分离并鉴定出核基质蛋白STRBP8只在SHEEC中表达,RT鄄PCR分析发现STRBP8mRNA也只出现在SHEEC细胞中。将其cDNA序列插入pGEM鄄Teasy载体后,经转化和筛选获得含STRBP8的阳性克隆。测序结果显示克隆得到的STRBP8cDNA片段与Genbank数据库上的序列完全一致。结论:STRBP8作为一种新?
- 熊兴东李恩民许丽艳刘新光蔡唯佳韩雅莉沈忠英
- 关键词：食管肿瘤核基质蛋白双向电泳MALDI-TOF-MS
- 酵母双杂交技术的影响因素及其实验策略被引量：20
- 2005年
- 目的 为了研究蛋白质分子间的相互作用 ,以大T抗原和P5 3为阳性对照 ,建立酵母双杂交实验系统。方法 通过比较共转化、顺序转化和交配实验三种方法的优劣 ,分析了影响酵母转化效率的因素 ,与此同时还分析了酵母体内 β 半乳糖苷酶的活性。 结果 ①顺序转化比共转化转化效率高 ;②质粒纯度是影响酵母转化效率的一个主要因素 ,与经典碱裂解法提取质粒相比 ,试剂盒提取质粒的转化效率明显高 ;③PEG浓度对转化效率也有一定影响 ;④β 半乳糖苷酶定量分析能够区分蛋白质分子间的强相互作用与弱相互作用 ,实验结果更可靠。结论 在此基础上 ,我们提出了一种共转化与交配实验有机结合的有效的酵母双杂交新实验策略 ,并将之成功运用于筛选NGAL(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin ,NGAL)相互作用蛋白实验。
- 方玉楷许丽艳麦瑞琴韩溟牛永东李恩民
- 关键词：酵母双杂交技术Β-半乳糖苷酶活性
- NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定被引量：11
- 2004年
- 目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和
- 许丽艳李恩民蔡唯佳王子良牛永东沈忠英曾毅
- 关键词：食管癌细胞基因表达调控荧光素酶
- 质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响
- 2005年
- 背景与目的 :探讨影响嵌套缺失反应的重要因素 ,找出相应的解决方案。材料与方法 :以构建好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin,NGAL)基因5’端调控区质粒pGLB_G6为研究对象,采用碱裂解法、聚二乙醇纯化法及QIAGEN试剂盒等3种不同方法制备该质粒 ,分别研究ExoⅢ对它们进行非特异性切割的敏感性 ,选出对ExoⅢ不敏感的质粒制备方法 ;在22℃和37℃分别进行缺失反应 ,琼脂糖凝胶电泳监控 ,以确定缺失反应是否已经发生 ;应用PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子。 结果 :QIAGEN试剂盒制备的质粒对ExoⅢ的非特异性切割最不敏感 ,可用于进行下一步的缺失反应 ;在22℃进行缺失反应时 ,电泳鉴定发现DNA片段的长度没有明显的变短 ,而在37℃时 ,同一反应体系的DNA片段长度明显缩短 ;进一步用限制性内切酶酶切可筛除PCR中的假阳性 ,获得准确的缺失子。 结论 :质粒的质量是确保进行特异性缺失反应的关键因素 ,通过QIAGEN试剂盒制备的质粒质量较好 ;设立一个37℃缺失对照管可作为判断低温条件下是否发生缺失的标准 ;PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子 ,可确保获得特异的缺失子。
- 王子良许丽艳李恩民
- 关键词：影响因素NGAL基因
- 酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白
- 2005年
- 目的:中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋 白(neutrophilgelatinase assiociatedlipocalin, NGAL)功能不明,籍筛选与之相互作用蛋白, 构筑相互作用图谱,为揭示其功能提供新途径。 方法:利用蛋白质相互作用原理,应用酵母双杂 交技术,构建pGBKT7 NGAL载体,以NGAL 为诱饵,在人类骨髓cDNA文库中筛选与之相 互作用蛋白的基因。结果:通过酵母交配筛库、 一对一验证和β gal分析筛选出40个阳性克 隆;测序,利用网上数据库(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)对序列进行比对,初步确定了31 种基因,其中11种为未知基因,20种为已知基 因。已知基因中含有编码区的有LGALS1、 MT2A、COX1、RNP24、ATP1B3、IGL、IGH VDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2。结论: 筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的 基因,这为研究NGAL功能及作用机制提供了 新途径。
- 麦瑞琴许丽艳方王楷韩溟牛永东王子良李恩民
- 关键词：癌基因蛋白相互作用
- NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的:将不同长度的NGAL基因 3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧 翼非翻译序列)克隆到pGL3 Promote (pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素 酶活力,确认NGAL3′端序列中是否含有增 强子或抑制子元件。方法:应用PCR技术 从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同 长度的NGAL基因片段F5(1880bp)和F (826bp),将其克隆到pGEM Teasy载体 并测序验证;再亚克隆到pGL3 Promoter载 体中,获得pGLP F5和pGLP F7表达载体 将pGLP F5和pGLP F7载体分别与pRL TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞 通过检测相对荧光素酶活力,确认这些 NGAL基因片段中是否含有增强子元件 结果:我们成功构建了pGLP F5和pGLP F 重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞 与pGL3 Promoter相比,酶活力未表现出明 显的增强或减弱。结论:在本研究的实验 条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的 顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不 明显。
- 丘碧波许丽艳邱文冰黄丽娜吴梦峰牛永东李恩民
- 关键词：食管肿瘤基因表达调控
