国家自然科学基金(31060332)
- 作品数：14 被引量：19H指数：3
- 相关作者：马学恩于立新么宏强周艳喜周建华更多>>
- 相关机构：内蒙古农业大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中华人民共和国农业部更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立
- 2011年
- 为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA。通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系。间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达。JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台。
- 刘霄卉罗军荣斯日古楞周建华马学恩
- 关键词：跨膜蛋白真核表达HEPG2细胞系
- 绵羊肺腺瘤LAMP快速诊断方法的初步建立(英文)被引量：2
- 2013年
- 为了建立一种便捷、灵敏的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)检测技术,本研究根据exJSRV LTR设计2对特异性引物,建立JSRV的LAMP(loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)检测方法,对反应体系中的MgSO4Betaine Bst DNA PoLymerase dNTP引物浓度等分别进行了优化,并进行敏感性和特异性试验。结果表明:所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92%和100%。该方法为绵羊肺腺瘤病的临床检测和基层检疫提供了一种简便、实用的方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用。基于本技术的专利已获国家知识产权局批准(专利号ZL 2012 1 0274280.7)。
- 刘霄卉于立新罗军荣周艳喜刘畅幺宏强周建华马学恩
- 关键词：环介导等温扩增绵羊肺腺瘤病毒敏感性
- 内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析被引量：3
- 2012年
- 参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7 519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971.1的核苷酸同源性为90.4%。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。
- 周艳喜苏佳李靖刘霄卉马学恩
- 关键词：内源性绵羊肺腺瘤病毒PCR扩增全基因序列
- 内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析
- 2011年
- 参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。
- 苏佳周艳喜马学恩幺宏强赵晓慧
- 关键词：内源性绵羊肺腺瘤病毒
- 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达被引量：1
- 2012年
- 为探讨绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(OPAV-Env)引起肺泡Ⅱ型上皮恶变的机理,将真核表达质粒pcDNA3.1-env用体内转染试剂经尾静脉转染到幼龄大鼠体内,用RT-PCR及免疫组化法检测绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达,并采用SSCP法及基因克隆法结合序列分析检测H-ras基因是否发生突变。结果显示,绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠肺脏组织存在表达,但转染21d后和正常大鼠比较,未发现大鼠H-ras基因发生突变。
- 李靖瓦西力周艳喜么宏强于立新敖威华马学恩
- 关键词：绵羊肺腺瘤病毒RAS基因免疫组化单链构象多态性
- 绵羊肺腺瘤PCR诊断方法的建立及应用被引量：2
- 2011年
- 利用特异性PCR方法实现对绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)快速精确诊断和病毒类型的分析。参照GenBank中公布的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列,针对病毒env基因YXXM基序设计了特异性PCR引物,建立了特异性PCR检测方法。成功扩增出病毒囊膜基因(env)多变区序列片段(ST)通过序列比对确定病毒类型。此方法操作简便,可用于绵羊肺腺瘤的快速诊断,可望在绵羊肺腺瘤发病机制等研究中起到重要作用。
- 周艳喜苏佳李靖刘霄卉马学恩
- 关键词：绵羊肺腺瘤病毒聚合酶链反应
- 稳定表达绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白A549细胞系的建立被引量：1
- 2011年
- 为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系。采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞。通过G418筛选,对转染阳性细胞进行纯化,获得稳定表达JSRVSU蛋白的A549细胞系。以间接免疫荧光及westernblot鉴定SU的表达状况,并运用共聚焦显微镜确认SU蛋白的亚细胞定位。结果表明,重组蛋白SU在A549细胞中有效表达,而且主要分布于细胞质中。该细胞系的建立为SU生物学功能的体外研究提供了平台。
- 刘霄卉罗军荣斯日古楞周建华马学恩
- 关键词：绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白真核表达细胞内定位
- 绵羊肺腺瘤kras和其他相关基因突变的检测被引量：3
- 2013年
- 为了解绵羊肺腺瘤与基因突变的关系,从绵羊肺腺瘤病毒感染的病羊肺脏组织扩增kras、nras、pik3ca、egfr、p53基因突变频率高的位点所在外显子核苷酸序列,应用PCR-SSCP技术和测序分析检测基因突变。结果显示,nras、pik3ca、egfr基因未检测到突变。2个阳性样品kras基因第1外显子检测出突变,核苷酸突变为点为35G→T,编码的氨基酸位于第12密码子为12G→V。1个阳性样品p53基因第7外显子检测出突变,核苷酸突变位点为825T→C,编码的氨基酸未发生突变,依然是C。为绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)分子致病机制的研究提供了参考资料。
- 周艳喜于立新张月梅敖威华朱富余么宏强马学恩
- 关键词：绵羊肺腺瘤病毒RAS基因P53基因信号转导
- 1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒的序列测定与分析
- 2012年
- 参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。
- 周艳喜李靖敖威华刘霄卉于立新幺宏强马学恩
- 关键词：全基因序列PCR扩增
- 绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株前病毒全基因组克隆及序列分析被引量：4
- 2014年
- 为了探究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙古流行株与国际各代表株间的亲缘关系,本研究以内蒙古地区绵羊肺腺瘤病自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与本实验室先期制备并保存的LTR、env基因连接起来,得到了含有JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组重组质粒pMD-JSRV。序列分析结果表明,JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组全长7 690bp,具外源性JSRV典型的分子特征:1在gag基因中含Sca I酶切位点;2核衣壳蛋白区有2个保守的可形成锌指结构的"CCHC"基序;3env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性"YXXM"基序。将其进行同源性分析,结果表明该株病毒属JSRV-II型,与分离自美国的代表株AF105220间亲缘关系较近,同源性达95%。本研究为进一步探讨JSRV内蒙古分离株基因组结构特点与其致病机制间的关系奠定了基础。
- 刘畅李磊于立新么宏强周建华马学恩
- 关键词：绵羊肺腺瘤病毒克隆
