国家教育部博士点基金(20110093120001)
- 作品数：8 被引量：21H指数：3
- 相关作者：饶志明徐美娟张显许正宏杨套伟更多>>
- 相关机构：江南大学更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程更多>>
- 耐热β-淀粉酶高产菌株的筛选及其产酶条件优化被引量：6
- 2013年
- 为丰富产耐热β-淀粉酶菌种资源,从土样中筛选得到高产淀粉酶菌株B10-54,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).经硫酸铵沉淀、阴离子交换柱分离纯化获得β-淀粉酶,测定其最适作用温度为65℃,最适pH为6.0,Ni2+、Mg2+离子对其酶活有促进作用.对B10-54发酵产β-淀粉酶进行优化,确定最适培养基碳氮源为木薯粉2%、豆粕粉4%,最适发酵条件为初始pH 7.0、温度37℃、转速190 r/min、接种量4%,摇床培养64 h后酶活力可达6 724 U/mL,比优化前提高了3.06倍.在装液量为2.5 L的5 L发酵罐中发酵,转速350 r/min,通气量1 L L-1min-1,控制pH在6.5-7.5之间,发酵48h后酶活可达最高酶活6 920 U/mL,比摇瓶培养缩短了发酵时间.因此菌株B10-54产耐热β-淀粉酶并可利用廉价原料木薯、豆粕粉发酵,可大大降低生产成本.
- 邹艳玲徐美娟饶志明
- 关键词：枯草芽孢杆菌Β-淀粉酶菌种筛选发酵条件优化
- pH与溶氧控制对解淀粉芽胞杆菌发酵粗甘油生产2,3-丁二醇的影响被引量：3
- 2013年
- 首次利用一株安全菌株解淀粉芽胞杆菌发酵生物柴油副产物粗甘油生产2,3-丁二醇。溶氧和pH是影响微生物法生产2,3-丁二醇的最主要因素。结果表明,发酵过程中不控制pH更有利于2,3-丁二醇合成;采用三阶段控制搅拌转速策略,2,3-丁二醇产量最大值达到38.1 g/L,生产强度达到1.06 g/(L·h),与恒定转速获得的最好结果相比,分别提高了14.8%和63.1%。采用脉冲流加发酵时,2,3-丁二醇产量达到71.2 g/L,2,3-丁二醇生产强度达到0.99 g/(L·h),这是目前报道的利用粗甘油合成2,3-丁二醇的最高产量。
- 杨套伟饶志明张显徐美娟许正宏
- 关键词：粗甘油PH流加发酵2,3-丁二醇
- 一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达被引量：5
- 2013年
- 从Bacillus subtilis L5-20染色体上克隆得到ALDC基因alsD,构建重组表达载体pMA5-alsD-His,将其转化到B.subtilis WB600中。SDS-PAGE结果显示ALDC在重组B.subtilisWB600中成功表达,其相对分子质量(Mr)为32×103。采用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC,所得纯酶的比酶活为272.3 U/mg,总回收率为89.8%。该重组ALDC最适反应温度仅为25℃,在20～35℃范围内均表现出较高的活性。Ni2+对ALDC有一定的激活作用,Fe3+使ALDC活性完全丧失。经摇瓶培养,重组菌的ALDC酶活为27.0 U/mL,约为出发菌酶活的70倍。经5 L的发酵罐发酵放大试验,ALDC酶活最高可达75.9 U/mL。
- 李静静徐美娟张显饶志明
- 关键词：枯草芽孢杆菌Α-乙酰乳酸脱羧酶耐低温双乙酰酶学性质
- 钝齿棒杆菌溶氧诱导型启动子的筛选及其功能验证被引量：1
- 2013年
- 【目的】筛选钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5内源溶氧诱导型启动子,验证其在不同溶氧条件下受溶氧调控的功能。【方法】以本课题组前期利用双向电泳结合质谱鉴定技术分离鉴定出的高低供氧条件下钝齿棒杆菌SYPA5-5胞内的显著差异蛋白(27个)为基础,结合棒杆菌基因组信息分析高低溶氧状态下显著差异蛋白中单位拷贝的表达量,以其中单位拷贝表达量高的蛋白为目的蛋白,克隆目的蛋白编码基因的上游启动子,分别替换棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pDXW-8的外源tac启动子,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中表达报告基因gfp和cat,并检测其表达效率。【结果】筛选出高溶氧上调蛋白转酮醇酶和延胡索酸水化酶作为目的蛋白,克隆其启动子区命名为P-tkt和P-fum。在重组大肠杆菌和重组钝齿棒杆菌中,P-tkt在高溶氧条件下CAT活性是低溶氧条件下CAT活性的2.8和3.2倍。该结果在5 L发酵罐中得到验证。【结论】启动子P-tkt为首次筛选到的钝齿棒杆菌内源性高溶氧诱导型启动子,适用于高溶氧条件发酵生产氨基酸的菌株中,有利于在高供氧条件下提高棒杆菌中氨基酸的合成代谢能力。
- 张博慧徐美娟饶志明许正宏
- 关键词：钝齿棒杆菌诱导型启动子
- 加强表达6-磷酸果糖激酶提高Bacillus subtilis乙偶姻合成效率被引量：1
- 2015年
- 乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要胞外产物,它是一种广泛使用的食用香精,同时也可作为重要的化学中间体,因此提高枯草芽孢杆菌乙偶姻的产量和生产效率有重要意义。本研究克隆了编码枯草芽孢杆菌6-磷酸果糖激酶(PFKA)和丙酮酸激酶(PK)的编码基因pfk A和py K,并分别将其在高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌BM(敲除了2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因bdh A)中过量表达。结果表明过量表达PFKA或者PK能有效提高糖酵解速率以及发酵过程的生物量,并且过量表达PFKA与过量表达PK相比更有利于乙偶姻的合成。在5 L发酵罐上对工程菌进行发酵实验发现,经底物流加发酵,乙偶姻产量达到66.8 g/L,生产效率达到0.74 g·(L·h)-1。本研究为利用枯草芽孢杆菌作为细胞工厂生产相关化合物有重要的借鉴意义。
- 张显赵晓静饶志明杨套伟徐美娟
- 关键词：乙偶姻枯草芽孢杆菌代谢工程丙酮酸激酶
- 产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化被引量：1
- 2014年
- 笔者所在实验室前期筛选到1株产脂肪酶粘质沙雷氏菌,克隆其脂肪酶基因,构建重组枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-lipA,成功实现了来源于粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达。基于以上工作基础上,对B.subtilis 168/pMA5-lipA进行了摇瓶水平上的产酶发酵优化。首先通过单因素和正交试验确定了有利于产脂肪酶的最佳培养基成分,并对发酵条件进行了优化。结果表明:优化后的培养基组分为蔗糖35 g/L,玉米浆27.5 g/L,(NH4)2SO41.25 g/L,CaCl24 g/L,pH 7.0。在最优发酵培养基的条件下,37℃、160 r/min摇床培养33 h,每毫升发酵液中重组菌脂肪酶酶活可达98.6 U,是优化前的3倍。
- 司冠儒徐美娟饶志明
- 关键词：枯草芽胞杆菌发酵脂肪酶粘质沙雷氏菌
- 羟丙基-β-环糊精对新金色分枝杆菌合成ADD蛋白质组的影响
- 2016年
- 新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum JC-12)可降解植物甾醇合成药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),由于植物甾醇的溶解度较低,因此在转化体系中添加羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为助溶剂.本次研究在HP-β-CD存在与否条件下利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOFMS)分离和鉴定新金色分枝杆菌蛋白质表达量的差异;再使用反转录实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对挑选出的5个与ADD合成相关的蛋白质编码基因进行转录水平分析.结果表明,2-DE图谱及质谱结果共鉴定到12个具有显著差异表达量的蛋白质点.其中,参与植物甾醇降解合成ADD途径的乙醇脱氢酶、烯酰-Co A水合酶、乙酰-Co A乙酰基转移酶、3α,7α,12α-三羟基-5β-胆甾-24-烯酰-Co A水合酶和4,5-9,10-双断裂-3-羟基-5,9,17三氧雄甾-1(10),2-二烯-4-酸酯水解酶的蛋白质表达量在羟丙基-β-环糊精存在条件下显著提高;参与糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢的乙二醛酶、3-氧代酰基-ACP合酶、3-酮脂酰-ACP还原酶、分支酸合酶、氮调节蛋白P-II和DNA结合蛋白的蛋白质表达量也有一定的提高,但磷酸甘油酸变位酶的蛋白质表达量有所下降.通过RT-q PCR分析的转录水平的变化情况与2-DE得到的蛋白水平的结果相符.综上所述,羟丙基-β-环糊精可促进降解植物甾醇合成ADD代谢途径及糖、脂、氨基酸和核酸类物质代谢途径相关酶的表达量.
- 吴丹张显饶志明邵明龙陈亚玲徐美娟杨套伟
- 关键词：植物甾醇羟丙基-Β-环糊精双向电泳
- 以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建被引量：4
- 2013年
- 【目的】为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产。【方法】运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad。通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因ΔargB。利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-ΔargB::tacgad,以ΔargB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatumΔargB::tacgad。重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量。【结果】重组菌C.crenatumΔargB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成。通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA。【结论】本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成。本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础。
- 孙红梅饶志明李秀鹏徐美娟张显许正宏
- 关键词：Γ-氨基丁酸钝齿棒杆菌同源重组谷氨酸脱羧酶
