国家自然科学基金(30400381)
- 作品数：18 被引量：66H指数：5
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- 表达Ag85B-ESAT6的重组卡介苗在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力被引量：3
- 2006年
- 师长宏安家泽王晓武张海徐志凯柏银兰薛莹
- 关键词：重组卡介苗AG85B免疫应答保护力小鼠结核病疫苗
- 表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗的免疫学特性
- 2005年
- 目的测定表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只),将表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF分别免疫小鼠3次,每次间隔2周,同时设卡介苗(BCG)免疫组、空载体质粒免疫组和生理盐水对照组。最后一次免疫结束后,每组取5只小鼠血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗体的滴度,并分离小鼠的脾淋巴细胞,并在体外用结核分枝杆菌(MTB)培养滤液蛋白(cu lture filtrate prote in,CFP)刺激,测定脾淋巴细胞增殖指数和γ干扰素(IFN-γ)水平。用1 m l含1×105克隆形成单位(CFU)的MTB毒株H37Rv经尾静脉感染其余每组5只BALB/c小鼠,4周后计数脾脏细菌负荷数。结果质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1∶1 000和1∶1 500。其脾淋巴细胞刺激指数分别为2.2和2.4,而生理盐水对照组和空载体质粒免疫组的刺激指数只有0.9和1.1;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ分别为(5.48±0.38)ng/m l和(5.76±0.51)ng/m l,显著高于生理盐水对照组和空载体质粒免疫组(P<0.05),但与BCG免疫组的(5.55±0.31)ng/m l比较差异无统计学意义。结核毒株攻击后,与空载体质粒免疫组相比,质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫的BALB/c小鼠其抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,3组脾脏细菌负荷对数值(lg,CFU/g)分别为6.08±0.25、4.63±0.11、4.50±0.32,但不及BCG免疫组的4.09±0.27。结论表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗在小鼠体内诱导的IFN-γ水平与BCG相当,其保护力有待进一步提高。
- 师长宏王晓武朱德生徐志凯柏银兰薛莹
- 关键词：基因融合
- Hsp65与IL-2融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答及保护力被引量：3
- 2008年
- 目的研究Hsp65与hIL-2的融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法在大肠杆菌中诱导表达Hsp65与hIL-2的融合蛋白,通过Ni-NTA亲合柱纯化后的蛋白经鉴定后,与佐剂DDA和MPL联合免疫小鼠,连续免疫3次,每次间隔2周,最后一次免疫结束后两周,分离5只小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖指数,IFN-γ和IL-2水平,以及特异性淋巴细胞杀伤功能,其余5只免疫小鼠用于MTB毒株攻击实验。结果获得融合蛋白可分别与抗Hsp65和抗hIL-2的单抗发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞被有效活化,诱导产生的-γIFN和IL-2的水平以及CTL杀伤功能均显著高于BCG和单纯Hsp65免疫组(P<0.05)。融合蛋白免疫组可有效抵抗MTB毒株攻击,脾脏细菌数显著减少(4.36±0.48),提供的保护力与BCG相当(4.30±0.53)。结论Hsp65与hIL-2的融合蛋白是一种有效的亚单位疫苗,可用于TB的预防。
- 师长宏张海席丽张廷芬赵勇王丽梅徐志凯
- 关键词：热休克蛋白65人白细胞介素2
- 结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力被引量：16
- 2006年
- 目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。
- 张海师长宏薛莹柏银兰王丽梅徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT6CFP10重组融合蛋白
- 结核分枝杆菌RPF蛋白的生物学特性及其在结核病疫苗研究中的应用被引量：4
- 2006年
- 师长宏徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌F蛋白结核病疫苗生物学特性藤黄微球菌
- 结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立
- 2006年
- 建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B-ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过BT-PCR检测到该细胞中有 Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。
- 师长宏安家泽唐小凤王晓武张海柏银兰徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌细胞系AG85BESAT6基因融合
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达被引量：5
- 2005年
- 目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点 亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定 正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT PCR方法检测 mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果:PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致,大小约为 350bp.重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合 esat6 cfp10基因片段.RT PCR可获得大小约为350bp的 cfp10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6 Cfp10蛋白的阳 性细胞着染.结论:成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因,构建 了融合有esat6 cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行 了表达.
- 张海师长宏薛莹姜泓高雪柏银兰王丽梅徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT6CFP10基因疫苗真核表达
- 结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力被引量：11
- 2006年
- 目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.最后一次免疫完成后4wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4wk后计数脾脏细菌负荷数.结果:MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFNγ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17)μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L].与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22).结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.
- 师长宏安家泽唐小凤王晓武张海柏银兰徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌疫苗MPT64ESAT6
- 胞壁表达HSP65-IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建和鉴定
- 2008年
- 目的:获得胞壁表达结核分枝杆菌热激蛋白65(HSP65)和人白细胞介素2(IL-2)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法:将HSP65和IL-2融合基因克隆入大肠杆菌-卡介苗(E.coli-BCG)穿梭质粒pCW,构建成重组质粒HSP65-IL-2-pCW,电穿入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选和PCR方法选取阳性克隆;用间接免疫荧光法对重组耻垢分枝杆菌进行表型鉴定;用重组耻垢分枝杆菌免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的抗体水平。结果:筛选获得的重组耻垢分枝杆菌增殖特性与普通耻垢分枝杆菌无明显区别;与抗人的IL-2抗体和HSP65抗体均可形成免疫印迹条带;间接荧光染色后,可见细菌表面有极强的绿色荧光;重组耻垢分枝杆菌免疫BALB/c小鼠2周后,小鼠血清中HSP65抗体平均滴度为1∶4000,而生理盐水组的抗体几乎为阴性。结论:结核分枝杆菌HSP65和人IL-2融合基因在耻垢分枝杆菌胞壁获得表达,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。
- 栗文彬师长宏张海张廷芬王丽梅赵勇白冰
- 关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌白细胞介素2融合蛋白
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因稳定表达细胞系的建立被引量：5
- 2005年
- 目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型。方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,多轮筛选过后分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA610,RT-PCR结果证明esat6-cfp10融合基因已稳定整合在转染P815细胞染色体上,间接免疫荧光检测后表达有ESAT6-CFP10蛋白的阳性细胞着染。结论获得了稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测结核杆菌DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础。
- 张海薛莹姜泓高雪师长宏柏银兰王丽梅徐志凯
- 关键词：分枝杆菌结核ESAT6CFP10
