国家自然科学基金(81041101)
- 作品数：9 被引量：36H指数：4
- 相关作者：王雪峰何援利付霞霏叶小凤刘木彪更多>>
- 相关机构：南方医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 携带Bcl-2基因的慢病毒对磷酰胺氮芥抑制卵巢颗粒细胞体外分泌功能的影响
- 2012年
- 目的:探讨携带Bcl-2基因的慢病毒抑制磷酰胺氮芥(PM)对体外培养的人原代卵巢颗粒细胞(GCs)的凋亡情况及其分泌功能的影响。方法:实验分4组:实验组,pGC-FU-Bcl-2+PM;空载对照组,pGC-FU-EGFP+PM;实验对照组,只加PM;正常对照组,不加PM及病毒。采用DNA ladder检测GCs凋亡情况,利用放射免疫法检测细胞培养上清液中雌二醇及孕酮的浓度。结果:实验对照组及空载对照组的DNA ladder表现为明显的梯状带形,正常对照组及实验组DNA ladder无明显的梯状带形。各组之间雌二醇及孕酮的基础浓度经统计学分析表明差异无显著性,实验组与相应时间点实验对照组及空载对照组相比差异均存在显著性(P<0.01),实验对照组与空载对照组相比差异无显著性(P=0.990,P=0.523)。结论:携带Bcl-2基因的慢病毒感染人原代卵巢GCs后,显著降低了PM诱导的细胞凋亡,改善了GCs在体外分泌雌二醇及孕酮的功能。
- 王雪峰何援利蔡慧华朱洪磊
- 关键词：基因BCL-2慢病毒分泌功能
- 携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡被引量：1
- 2013年
- 背景:慢病毒可以感染分裂及非分裂细胞,对于较难转染的原代卵巢颗粒细胞,慢病毒能否成功进行感染?目的:探讨携带bcl-2基因的慢病毒感染原代人卵巢颗粒细胞的效率及对细胞凋亡的影响。方法:利用分子生物学技术,构建携带bcl-2基因慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(10,50,100,200,400)感染人卵巢原代颗粒细胞,感染24,48,72,96h后观察感染效率及细胞增殖情况,同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,利用反转录聚合酶链反应检测bcl-2基因的转录情况。结果与结论:原代培养人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当感染复数为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,其在颗粒细胞中的阳性率达60%;携带bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞,可以过度分泌Bcl-2蛋白,能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。
- 王雪峰谭峰陈燕英刘木彪何援利
- 关键词：BCL-2基因慢病毒卵巢颗粒细胞基因转染卵巢早衰
- Foxo3a基因调控大鼠卵巢颗粒细胞体外发育及预防顺铂对卵巢的毒性作用被引量：7
- 2016年
- 目的研究Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的调控及其预防顺铂卵巢毒性作用。方法大鼠原代颗粒细胞体外培养,利用HE染色法及免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定;构建携带Foxo3a基因的重组腺病毒AD-r Foxo3a,利用RT-PCR及Western-blot法检测Foxo3a表达;实验分为3组:实验组(AD-r Foxo3a组)、阴性对照组(r AD组)及空白对照组(Control组),分别绘制各组细胞生长曲线,Western-blot法检测各组cyclin D1、p27、Bax、Bim蛋白表达,利用流式细胞术、Hoechst33342/PI法分别检测细胞周期及细胞凋亡情况,流式细胞术检测各组细胞加入最适浓度顺铂后细胞凋亡情况。结果(1)体外分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞存活率>90%,细胞纯度>95%;(2)重组腺病毒AD-r Foxo3a感染颗粒细胞36 h后Foxo3a基因在m RNA水平高表达,感染48 h后在蛋白水平高表达;(3)实验组细胞增殖受到抑制,G1期细胞比例及细胞凋亡率较空白对照组及实验对照组增加(P<0.01),后两组差异无统计学意义;(3)实验组Bim、p27、cyclin D1蛋白较对照组高表达,而各组Bax蛋白表达无明显差异;(4)加入顺铂24 h后实验组细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组(P<0.01),后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。结论过表达Foxo3a基因在体外可能通过促进cyclin D1和p27蛋白表达诱导大鼠卵巢颗粒细胞静止在G1期,通过增加Bim蛋白表达诱导颗粒细胞凋亡;同时过表达Foxo3a基因在体外不能逆转顺铂导致的颗粒细胞凋亡,其对于卵泡发育的调控及预防顺铂对卵巢的毒性作用还有待体内实验进一步研究。
- 杨玥房丽红王雪峰
- 关键词：重组腺病毒卵巢颗粒细胞顺铂
- 骨髓间充质干细胞移植治疗顺铂致卵巢的化疗性损伤被引量：7
- 2015年
- 背景:化疗药物可使处于生育年龄女性患者卵巢功能有不同程度的损伤,重则致卵巢早衰,已成为卵巢早衰发病的一个重要原因。因此,改善和恢复患者卵巢功能,已成为一个重要的课题。目的:探索骨髓间充质干细胞治疗化疗所致卵巢损伤的可行性及疗效。方法:建立化疗性卵巢衰竭模型,建模后注射PKH26标记后的骨髓间充质干细胞,于移植细胞后第15,30,45,60天,各取5只大鼠经尾静脉取血测卵泡刺激素、雌二醇水平并处死大鼠,留取右侧卵巢行常规病理切片,光学显微镜下记录卵巢卵泡数量变化。细胞移植后30 d,取2只大鼠与雄鼠合笼,观察生殖能力的差异。结果与结论:18%(4/22只)大鼠移植干细胞后动情周期能逐渐恢复,卵泡刺激素水平有所下降而雌二醇水平上升,卵巢病理切片提示卵泡数量减少,大鼠生育能力未受损害。结果表明骨髓间充质干细胞可以部分改善化疗后大鼠卵巢功能。
- 叶小凤何援利付霞霏王雪峰
- 关键词：卵巢疾病顺铂骨髓间质干细胞移植干细胞卵巢损伤PKH26
- 顺铂所致大鼠卵巢损伤动物模型的建立被引量：4
- 2011年
- 目的建立稳定可靠的卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)动物模型,以供基础实验研究。方法以Wistar雌性大鼠为研究对象,以不同剂量(3.0、4.5、6.0 mg/kg)顺铂腹腔注射,观察大鼠一般情况、动情周期、性激素(雌二醇和卵泡刺激素)水平、卵巢形态学及各级卵泡数的变化。结果顺铂可致大鼠体重下降,动情周期紊乱,雌激素下降,卵泡刺激素升高,各级卵泡计数减少,甚至在高剂量给药时能损害生育能力。结论分别于第1、8天腹腔注射6 mg/kg顺铂能引起大鼠卵巢功能明显衰退,生殖能力受损。该建立卵巢早衰动物模型的方案成功率高,造模周期较短,结果可靠,可以作为基础研究的动物造模。
- 叶小凤何援利付霞霏王雪峰
- 关键词：卵巢早衰顺铂
- 携带Bcl-2基因的慢病毒对原代培养的人卵巢颗粒细胞的影响被引量：3
- 2012年
- 目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对体外培养的原代人卵巢颗粒细胞感染效率及对细胞凋亡的影响。方法构建携带Bcl-2基因的慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(MOI)值(10、50、100、200、400)感染人卵巢原代颗粒细胞,观察感染24、48、72、96h后的感染效率及细胞增殖情况;将人卵巢颗粒培养24h后,分为3组。实验组:加MOI值为100的重组慢病毒GC-FU-Bcl-2;空白对照组:不加病毒;空载体对照组:加空载病毒GC-FU-EGFP。转染后第3、7天,采用Western blotting及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测目的基因Bcl-2在人卵巢原代颗粒细胞中的蛋白及mRNA的表达水平。同时转染后第3天采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果原代培养的人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当MOI为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,感染率达60%。携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后,实验组中检测到Bcl-2基因及蛋白的表达,且卵巢颗粒细胞的凋亡率明显低于空载体对照组。结论携带Bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞后可过度分泌Bcl-2蛋白,抑制细胞凋亡。
- 王雪峰何援利刘木彪付霞霏
- 关键词：基因BCL-2慢病毒感染粒层细胞
- 慢病毒介导的Bcl-2基因对磷酰胺氮芥诱导人原代卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用被引量：5
- 2012年
- 目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对磷酰胺氮芥诱导体外培养的原代人卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。方法利用分子生物学技术,成功构建携带Bcl-2基因慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒体外感染人卵巢原代颗粒细胞,再加入浓度30μmol/L的磷酰胺氮芥诱导细胞凋亡。分为4组进行实验:(a)实验组:pGC-FU-Bcl-2+磷酰胺氮芥(PM);(b)空载对照组:pGC-FU-EGFP+PM;(c)实验对照组:只加PM;(d)空白对照组:不加PM及病毒。采用流式细胞仪、Hoechst 33258染色检测卵巢颗粒细胞凋亡情况;利用Western blot检测Bcl-2蛋白的表达情况。结果空白对照组(GCs),凋亡峰不明显,颗粒细胞凋亡率为(1.93±0.28)%,实验组(GCs+PM+pGC-FU-Bcl-2)出现微弱的凋亡峰,颗粒细胞凋亡率为(6.99±0.55)%,比实验对照组(GCs+PM)及空载对照组(GCs+PM+pGC-FU-EGFP)显著低,但显著高于空白对照组(P<0.05)。实验组Bcl-2蛋白的表达明显增高,显著高于其余各对照组(P<0.05)。结论携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后可以过度分泌Bcl-2蛋白,显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,保护PM对颗粒细胞的理化损伤。
- 王雪峰何援利付霞霏彭冬先
- 关键词：BCL-2基因慢病毒化疗药物细胞凋亡
- 全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记被引量：7
- 2011年
- 背景:要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的:采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论:全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。
- 叶小凤何援利王雪峰付霞霏
- 关键词：骨髓间充质干细胞PKH26
- 慢病毒介导Bcl-2基因保护化疗大鼠卵巢损伤的作用及机制被引量：3
- 2013年
- 目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒局部注射保护环磷酰胺(CTX)损伤大鼠卵巢的作用及机制。方法将Wistar大鼠分为7组,每组16只,分别为空白对照组;CTX组(仅腹腔注射CTX);Bcl-2组;增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组;盐水+CTX组;空载+CTX组;实验组(注射pGC-FU-Bcl-2+CTX);将纯化的慢病毒悬液经开腹注射入双侧卵巢内,部分动物采用CTX经腹腔注射的方式建立卵巢早衰动物模型。采用HE病理切片计数各级卵泡数量,Tunnel法检测卵巢组织中颗粒细胞凋亡情况,Western blot检测Bcl-2蛋白定量。结果卵巢内直接注射慢病毒后,实验组各级卵泡数比空载+CTX组、盐水+CTX组及CTX组均明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2明显增加,卵巢颗粒细胞凋亡率明显下降。结论携带Bcl-2基因的慢病毒可防护CTX对卵巢组织结构的损伤,其发挥作用的途径之一则是上调Bcl-2蛋白,抑制卵巢颗粒细胞凋亡。
- 王雪峰何援利
- 关键词：BCL-2基因慢病毒化疗药物卵巢损伤
