国家自然科学基金(30871102)
- 作品数：12 被引量：34H指数：3
- 相关作者：冯文莉彭智史静李亚娟李会更多>>
- 相关机构：重庆医科大学湖南医药学院重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金湖南省教育厅科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- ABL SH3-T79Y突变体联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响被引量：5
- 2015年
- 目的分析慢性粒细胞白血病(CML)BCR-ABL蛋白的SH3结构域突变体(ABL SH3-T79Y)联合伊马替尼(IM)在体内外对CML细胞增殖的影响,并初步探讨其发挥作用的机制。方法构建重组腺病毒载体SH3-T79Y突变体,将其联合IM处理K562/G01细胞后,采用克隆形成实验检测细胞克隆形成率,流式细胞术检测细胞周期,分析K562/G01细胞体外增殖能力的变化。SH3-T79Y联合IM处理KCL22细胞,构建BALB/c裸鼠皮下实体瘤模型,计算皮下瘤形成率,摘取瘤体进行病理学检查,分析KCL22细胞体内增殖能力的变化。SH3-T79Y联合IM处理K562/G01细胞后,采用Western blotting检测p-BCR-ABL、BCR-ABL、p-Crk L、Crk L、Cyclin D1蛋白的表达水平,分析联合作用影响CML细胞增殖的机制。实验中以PBS、腺病毒空载体及IM单独处理细胞作为对照。结果相较于三个对照组,SH3-T79Y联合IM处理K562/G01细胞后,细胞克隆形成率(28.74%±6.64%)明显降低(P<0.05),细胞周期阻滞于S期。联合处理KCL22细胞后,KCL22-BALB/c裸鼠皮下实体瘤模型成瘤率为16.7%,明显低于IM单独处理组(33.3%)和PBS对照组(100%),瘤体病理学检查见大量增殖的瘤细胞;Western blotting检测结果显示联合处理后K562/G01细胞p-BCR-ABL、p-Crk L、BCRABL、Crk L及Cyclin D1的表达均降低。结论 SH3-T79Y联合IM通过抑制BCR-ABL、Crk L磷酸化和降低Cyclin D1表达,在体内、体外发挥了抑制CML细胞增殖的效应。
- 文良雪刘鑫李会黄宁姝黄峥兰冯文莉
- 关键词：细胞增殖白血病髓系慢性BCR-ABL阳性
- 携SH2-Caspase8融合基因重组腺病毒的构建及对K562细胞增殖的影响被引量：2
- 2011年
- 目的构建并鉴定携SH2-Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法采用RT-PCR、重叠PCR扩增SH2-Caspase8融合基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-SC-EGFP,进行酶切和测序鉴定。将PmeⅠ酶切后的穿梭质粒转化pAdEasy-BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAdE-SC-EGFP及其突变体,PacⅠ酶切后将其转染AD293细胞进行包装,PCR和Western blot鉴定重组腺病毒AdE-SC-EGFP,验证后扩增病毒并测定滴度。结果 PCR检测、酶切和测序结果均表明腺病毒穿梭质粒pAdT-SC-EGFP和重组腺病毒质粒pAdE-SC-EGFP构建成功;PCR检测、EGFP表达检测结果证明重组腺病毒AdE-SC-EGFP包装成功,扩增后,滴度可达1.5×1012pfu/ml。感染K562细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达,MTT和半固体集落形成实验检测其对K562细胞生长增殖的影响。结论成功构建并鉴定了携带SH2-Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体;MTT和克隆形成实验证明重组腺病毒AdE-SC-EGFP对BCR-ABL阳性的K562细胞有明显的增殖抑制作用。
- 刘双凤胡晶曹唯希史静彭智王海霞李亚娟冯文莉
- 关键词：细胞增殖SH2CASPASE8重组腺病毒K562细胞BCR-ABL
- 慢性粒细胞白血病急变基因机制的研究进展被引量：9
- 2015年
- 目前,慢性粒细胞白血病（CML）的治疗方法有传统的放、化疗,异基因造血干细胞移植和通过分子设计合成的低分子拮抗剂甲磺酸伊马替尼为代表的直接抑制BCR/ABL酪氨酸激酶活性（TKI）的靶向治疗。传统的放、化疗疗效差且不良反应多,异体造血干细胞移植供者有限及受患者年龄等条件的影响,限制了临床开展和实施。
- 王林费嫦冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病急变
- 重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定被引量：10
- 2011年
- 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响。方法设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经PmeⅠ酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF,PacⅠ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定。重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用。结论已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础。
- 史静彭智罗红伟曹唯希陶崑李亚娟王海霞冯文莉
- 关键词：重组腺病毒K562细胞细胞增殖
- 抗慢性粒细胞白血病细胞人源化单链抗体的原核表达及其活性被引量：1
- 2012年
- 目的原核表达抗慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)细胞人源化单链抗体(Humanized sin-gle-chain variable fragment,hscFv),并检测其抗原结合活性。方法从重组质粒pUC57-hscFv中扩增hscFv基因,插入含6×His标签的原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-hscFv,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE分析其纯度;Western blot分析其反应原性;间接免疫荧光试验检测其抗原结合活性。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约为46 000,表达量约占菌体总蛋白的37%,主要以可溶性形式存在;纯化的重组融合蛋白纯度为94%,可与鼠抗6×His单抗及K562细胞表面抗原特异性结合。结论成功原核表达并纯化了抗CML细胞hscFv,为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗奠定了基础。
- 朱小影王东李身锋张利军钟梁冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病人源化抗体原核细胞
- 重组腺病毒AdE-SH2-Caspase8对耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响被引量：1
- 2015年
- 目的:研究表达融合蛋白SH2-Caspase 8的重组腺病毒Ad E-SH2-Caspase 8-HA-GFP(SC)对BCR/ABL阳性的耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响。方法:K562/G01细胞经重组的腺病毒SC感染后,分别设突变Ad E-SH2m-Caspase 8-HA-GFP(Sm C)组、病毒空载Ad EGFP(CM V)组和PBS对照组。荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测病毒感染效率,Western blot检测融合蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达水平,光学显微镜观察经瑞氏染色后的细胞形态,FCM和DNA梯度电泳检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3和PARP的表达水平。结果:重组腺病毒在K562/G01细胞中的感染效率较高;Western blot能检测到目的蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达;与对照组比较,瑞氏染色后SC组出现明显的凋亡形态改变,FCM检测结果表明SC组早前凋亡细胞明显增高(P<0.05),DNA梯度电泳检测结果发现SC组出现明显细胞凋亡特异性的梯度条带,Western blot结果表明SC组凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP活化片段的表达水平升高。结论:重组腺病毒SC表达的SH2-Caspase 8融合蛋白能明显诱导K562/G01细胞的凋亡。
- 王林王林费嫦黄峥兰李会刘张玲
- 关键词：细胞凋亡BCR-ABL融合蛋白SH2结构域
- 重组腺病毒表达的融合蛋白SH2-caspase 8对K562细胞凋亡的影响被引量：1
- 2013年
- 目的研究表达融合蛋白SH2-caspase 8的重组腺病毒AdE-SH2-caspase 8-HA-GFP(SC)对BCR/ABL阳性的慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的影响。方法将重组的腺病毒SC转染K562细胞(SC组),分别设突变AdE-SH2m-caspase 8-HA-GFP(SmC)组、病毒空载体AdEGFP(CMV)组和PBS对照组。用荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测病毒转染效率,western blot检测融合蛋白及凋亡相关蛋白caspase 3、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)的表达情况,用光学显微镜观察经瑞氏染色后的细胞形态,FCM和DNA梯度电泳检测细胞凋亡情况。结果 FCM和荧光显微镜检查结果显示,重组腺病毒在K562细胞中的转染效率较高;融合蛋白SH2-caspase 8-HA和SH2m-caspase 8-HA可在K562细胞中表达;瑞氏染色后SC组出现明显的凋亡形态改变;FCM检测结果表明,SC组与SmC组、CMV组和PBS组相比较,其早期凋亡细胞明显增高(t分别为6.945、19.083和16.470,P均<0.05),DNA梯度电泳检测结果发现SC组和SmC组可出现细胞凋亡特异性的梯度条带,western blot结果表明,SC组和SmC组凋亡相关蛋白caspase 3、PARP活化片段的表达水平升高。结论重组腺病毒SC表达的SH2-caspase 8融合蛋白能明显诱导K562细胞的凋亡。
- 王林李会刘章玲祖白玲黄峥兰向华冯文莉
- 关键词：细胞凋亡SH2结构域融合蛋白K562细胞
- 重组腺病毒Ad5F35-SH2-DED对K562细胞裸鼠致瘤能力的影响被引量：1
- 2012年
- 目的:研究融合蛋白SH2-DED(SD)对白血病K562细胞裸鼠皮下移植瘤的影响。方法:建立K562细胞裸鼠皮下移植瘤的重组腺病毒预防和治疗模型。预防模型采用皮下注射经重组腺病毒Ad5F35-SD或Ad5F35-SmD预处理的K562细胞;治疗模型采用皮下注射K562细胞建立皮下移植瘤后,进行Ad5F35-SD或Ad5F35-SmD的瘤体内多点注射。观察裸鼠移植瘤的生长情况以及移植瘤肿瘤细胞的形态学变化。应用TUNEL法和电子显微镜观察移植瘤肿瘤细胞的凋亡情况。结果:治疗模型组中,Ad5F35-SD处理组移植瘤体积明显缩小,肿瘤细胞核浓缩,细胞质染色加深。TUNEL法和电子显微镜检测结果提示,肿瘤细胞发生凋亡,且凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8表达上调。Ad5F35-SD在预防模型组中同样具有抑制移植瘤生长的作用。结论:重组腺病毒Ad5F35-SD能够抑制K562细胞在裸鼠体内的致瘤能力以及裸鼠皮下移植瘤的生长,并促进肿瘤细胞凋亡。
- 邓晶荣史静肖青胡晶彭智罗秋平冯文莉
- 关键词：K562细胞
- 重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响被引量：3
- 2011年
- 目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。
- 史静胡晶肖青彭智曹唯希罗秋平王方冯文莉
- 关键词：SH2重组腺病毒
- 重组腺病毒AdE-SH2-Caspase8-HA-GFP对耐伊马替尼的K562/G01细胞增殖的影响
- 2013年
- 研究表达融合蛋白SH2-Caspase8的重组腺病毒AdE-SH2-Caspase8-HA-GFP对耐伊马替尼的BCR/ABL阳性的慢性粒细胞白血病(CML)K562/G01细胞增殖的影响。荧光显微镜观察病毒感染效率,Western blot检测融合蛋白的表达情况,MTT和细胞计数检测细胞的生长情况,流式细胞仪分析细胞增殖周期,甲基纤维素克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力。结果显示,荧光显微镜观察病毒感染效率高,Western blot能检测到目的蛋白的表达,MTT和细胞计数检测可见,与对照组相比AdE-SH2-Caspase8-HA-GFP能显著抑制细胞的生长;流式周期检测发现,AdE-SH2-Caspase8-HA-GFP组G1期细胞比例增加,S期和G2期细胞比例减少;克隆形成实验可见,AdE-SH2-Caspase8-HA-GFP能显著抑制细胞克隆的形成。综上所述,重组腺病毒AdE-SH2-Caspase8-HA-GFP表达的SH2-Caspase8融合蛋白能明显抑制耐伊马替尼的K562/G01细胞的增殖。
- 王林罗秋平黄峥兰李会刘张玲祖白玲冯文莉向华
- 关键词：细胞增殖BCRABLSH2结构域CASPASE8
