国家自然科学基金(31172306)
- 作品数：11 被引量：13H指数：2
- 相关作者：余为一陈芳芳倪庆胜孟凡涛刘生杰更多>>
- 相关机构：安徽农业大学阜阳师范学院更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 鲢鱼恒定链cDNA的克隆及其分子结构分析被引量：1
- 2013年
- 为研究鱼类恒定链(Invariant chain,Ii)的结构与功能,应用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNAends)法,从脾脏细胞中克隆了鲢(Aristichthys molitrix)Ii基因cDNA,并进行了测序。该基因cDNA全长为1 136bp,其中开放阅读框为699 bp,编码232个氨基酸。比对氨基酸序列发现,鲢与其他物种的Ii链有相同的结构域。将Ii基因cDNA片段和表达不同结构域的DNA片段分别插入真核表达质粒pEGFP-C1,转染真核细胞系COS7,发现鲢Ii跨膜区和胞浆区在细胞内具有定位作用。根据推测的氨基酸序列,分析不同种间Ii的同源性,表明鲢与斑马鱼(Brachydanio rerio)的同源性最高(78%),与人等哺乳动物Ii的同源性较低(30%～40%)。进一步模拟构建和比较不同物种Ii链的3D结构,显示链鱼和小鼠、人和鸡的Ii链结构非常相似,甚至在一些具有重要作用的氨基酸是相同的。上述结果表明,作为重要的免疫分子,不同脊椎动物的Ii链不仅在遗传上具有高度同源性,而且在结构方面仍保持着高度的相似性。
- 叶显峰孟凡涛刘洪明祖国掌
- 关键词：RACE克隆
- 用噬菌体肽库筛选IBDV单克隆抗体的模拟表位被引量：2
- 2012年
- 目的:筛选法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体所针对的模拟抗原表位。方法:以纯化的3株IBDV单克隆抗体为靶分子用噬菌体12肽库筛选相应抗原模拟表位;应用间接和竞争ELISA鉴定所筛选的阳性样品;最后对与抗体高亲和结合的噬菌体进行测序分析。结果:经过四轮淘洗,随机挑取30个克隆经间接ELISA鉴定,发现其中22个克隆结合活性较高。进一步应用竞争ELISA,获得14个噬菌体克隆,其抑制率高达50%以上。对这些噬菌体进行DNA测序,并分析比对了IBDV相应序列,确定了3个抗原模拟表位。结论:通过噬菌体随机肽库成功筛选出3个IBDV模拟表位,为进一步研究IBDV抗原性质奠定了基础。
- 李向红陈芳芳黄成斌余为一
- 关键词：噬菌体肽库单克隆抗体IBDV模拟表位
- 疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体制备及鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的制备抗疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体,鉴定其与组织抗原MDIi的反应性。方法以PCR扩增获得MDIi序列构建原核表达载体pET-32a/MDIi,转化大肠杆菌进行表达;对表达产物鉴定后,免疫小鼠制备抗MDIi多克隆抗体;间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体与疣鼻栖鸭组织MDIi的反应强度。结果成功构建了pET-32a/MDIi原核表达载体,诱导表达了相对分子质量(Mr)约40 000的包涵体形式的MDIi重组蛋白,免疫小鼠获得效价为1∶128 000的特异性多克隆抗体,抗体与疣鼻栖鸭组织中的MDIi反应滴度为1∶32 000。结论成功制备了高效价的特异性抗MDIi多克隆抗体,抗体与组织抗原有较强的免疫反应性。
- 刘生杰朱茂英陈德宇吴超倪庆胜余为一
- 关键词：多克隆抗体组织抗原
- 鸡B-LB基因在真核细胞中的表达
- 2012年
- B-LB基因编码的鸡MHC(major histocompatibility complex)Ⅱ类分子β链在MHCⅡ类分子递呈抗原中起重要作用。应用RT-PCR方法从鸡淋巴细胞中扩增了全长B-LB基因,其大小为792 bp。进一步经脂质体法,将其分别转染COS7和P815。B-LB基因表达在COS7的浆膜。经G418的筛选(0.6 mg/mL)得到稳定表达的B-LB的细胞株P815(B-LB)。将其培养10代次后,在RT-PCR中能获得相应DNA片段。上述结果表明B-LB基因能够在动物真核细胞中表达,并成功建立了能够稳定表达B-LB基因的P815(B-LB)细胞株,为进一步研究MHCⅡ类分子β链在免疫应答中的作用奠定了基础。
- 廖翔余为一
- 关键词：真核表达
- 恒定链CLIP的2个片段在增强体液免疫效果的比较被引量：2
- 2014年
- 【目的】比较恒定链(invariant chain,Ii)CLIP的2个片段(PBS、GBS)影响免疫载体增强体液免疫的效果。【方法】首先,构建了基于小鼠Ii功能片段与新城疫病毒抗原肽F2的6个嵌合体(Cyt/TM/F2、Cyt/TM/F2/GBS、Cyt/TM/PBS/F2、Cyt/TM/F2/TRIM、Cyt/TM/F2/GBS/TRIM、Cyt/TM/PBS/F2/TRIM);其次,定向克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达和纯化目的蛋白;最后,免疫小鼠,经间接ELISA法测定血清抗体效价,以及比较分析不同嵌合体免疫组免疫效果。【结果】一是所构建的含不同Ii功能片段/F2嵌合体的6个免疫组,均比单独F2的免疫组提高抗体水平1.5-4.9倍;二是在上述6个免疫组中,含CLIP的PBS或GBS的免疫组比不含CLIP的免疫组增强1.6-2.4倍;三是含PBS比含GBS的免疫组增强1.5倍。【结论】Ii胞浆区、跨膜区具有增强免疫效果的作用,而CLIP的PBS在Ii免疫载体中的作用优于GBS。
- 王瑞靖陈芳芳余为一
- 关键词：抗体CLIP
- 鸡恒定链活性片段和NDVF蛋白表位嵌合体的构建与鉴定
- 2012年
- [目的]为研究基于恒定链(Ii)分子片段的免疫载体提供试验材料。[方法]利用鸡恒定链的部分有免疫活性的片段作为免疫载体结构,构建含新城疫病毒F蛋白抗原片段的嵌合体。[结果]成功构建了Ii-key/F306、Ii-key/F306/AP、Cyt/Ii-key/F306和Cyt/Ii-key/F306/AP 4个嵌合体。重组质粒能被诱导表达相应蛋白分子,而且通过纯化获得95%高纯度。[结论]该试验中嵌合体的成功制备为动物免疫试验奠定了基础。
- 倪庆胜陈芳芳余为一
- 关键词：新城疫病毒融合蛋白嵌合体原核表达纯化
- 两种基于恒定链活性片段载体在增强抗体分泌中作用的比较被引量：5
- 2012年
- 目的:比较基于恒定链片段的两种载体的免疫效果和作用机理。方法:分别构建了含新城疫病毒抗原表位F306和Ii不同片段的三个嵌合体(Ii-key/F306、Ii-key/F306/ND(两个氨基酸残基)和用抗原表位取代Ii-CLIP的Ii/F306),经纯化后的融合蛋白免疫小鼠,并用ELISA检测其抗体效价。同时嵌合体与Mhc共转染COS7细胞,观察两者的细胞定位与结合。结果:Ii-key/F306免疫组比单独F306抗原肽免疫组的抗体效价提高2倍,Ii-key/F306/ND免疫组增至4倍,而Ii-F306免疫组只增强2.5倍。在与Mhc共转染的COS7细胞和免疫共沉淀中,Ii-key/F306和Ii-key/F306/ND既没有与MHCⅡ分子的膜共定位作用,也不能与后者结合;而Ii-F306却能与MHCⅡ分子在浆膜共定位,并与后者结合。结论:这些结果表明,嵌合体都具有增强免疫效果的作用,并提示Ii片段促进了抗原肽与MHCⅡ分子结合。
- 孟凡涛陈芳芳余为一
- 关键词：抗体共定位
- 鸡B-F2基因真核表达系统的建立与鉴定
- 2012年
- 鸡B-F2基因编码的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子α链在递呈内源性抗原中起重要作用。本研究应用RT-PCR方法从鸡外周血单核细胞中扩增了B-F2基因片段,其大小为1 068 bp。进一步将其定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-B-F2。经脂质体法转染COS7,所表达的α链定位于在细胞的浆膜,同时转染P815细胞,经G418的筛选(0.6 mg/mL)得到稳定表达细胞株。该细胞株经培养10代次后,仍在RT-PCR中能获得相应DNA片段。上述结果表明,B-F2基因在动物真核表达系统得到表达,建立的P815(B-F2)细胞株为进一步研究MHC I类分子α链在免疫应答中作用奠定了基础。
- 金园园陈芳芳余为一
- 关键词：真核表达系统
- 鸡恒定链功能片段跨物种增强小鼠对新城疫F2抗原免疫作用的研究被引量：1
- 2014年
- 【目的】研究恒定链（Invariant chain,Ii）功能片段作为载体的跨物种免疫增强作用及其潜在机制。【方法】构建基于鸡Ii功能片段与新城疫病毒抗原表位F2的嵌合体（Ii-F2、Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、Tm/Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2）,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a中,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）并用IPTG诱导表达,嵌合体融合蛋白纯化后免疫小鼠,用ELISA法测定血清抗体效价。同时,分别构建含鸡Ii和小鼠MHCⅡ类分子基因的真核表达载体,并将其共转染COS7细胞,通过激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的共定位。【结果】用F2与Ii-key等Ii功能片段连接的融合蛋白免疫的试验组小鼠的抗体效价,较单独用F2抗原肽免疫的对照组小鼠产生的抗体效价提高了1.5~3倍。显微观察发现,鸡Ii和小鼠MHCⅡ分子在细胞内可以共定位。【结论】Ii具有跨越物种限制增强免疫的作用。
- 王琛刘雪兰陈芳芳余为一
- 关键词：嵌合体
- 鸳鸯鸭恒定链两异构体组织转录模式研究被引量：1
- 2014年
- 为探索鸳鸯鸭恒定链(MDIi)两种异构体MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录模式,建立了检测MDIi-1和MDIi-2组织转录的实时相对定量PCR方法,检测并分析了MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录特点。结果显示MDIi-1在法氏囊底部的转录水平为各组织或器官中最低(设为校正器);和校正器比较,MDIi-1在脾和小肠黏膜呈最高水平转录,而法氏囊颈部、肝、肾、胸腺和血液也呈较高水平转录,其他器官均低水平转录;MDIi-2在脾、法氏囊颈部和小肠黏膜也呈超过校正器的高水平转录,胸腺、肺和肾的转录水平仅略低于校正器,其他组织或器官转录水平都远低于校正器,呈极低水平转录。同一组织或器官中MDIi-1转录水平远高于MDIi-2,但MDIi-1和MDIi-2在所有被检组织或器官中转录具有很高的相关性,相关性系数达0.850 7。MDIi-1和MDIi-2共转录于所有被检组织或器官中,每一组织或器官中MDIi-1是主要转录形式,在所有被检组织或器官中两异构体均高转录于具有免疫防御功能的器官或组织,MDIi-1和MDIi-2差异性转录的试验结果为后续两异构体功能机制和基于MDIi的基因疫苗研究提供了基础资料。
- 刘生杰吴超倪庆胜余为一
- 关键词：鸳鸯鸭异构体
