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- 乔永利朱晓果房迪李蝶张佳宁
- 一种海藻糖合酶突变体及其应用
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- 张建涛张建波马春艳李志敏林玉房鸣
- 一种海藻糖合酶突变体及其制备和应用
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- 刘伟杰景栋徐明
- 粘细菌Myxococcus sp.CYD-1海藻糖合酶基因克隆及酶学特性分析被引量:1
- 2023年
- 【目的】海藻糖合酶(trehalose synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。本文以粘细菌Myxococcus sp.CYD-1为材料,挖掘新的海藻糖合酶资源。【方法】以菌株CYD-1基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因MCTs,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni^(2+)-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH、温度和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株CYD-1基因组中克隆到一个编码海藻糖合成酶的基因MCTs。MCTs全长1659 bp,编码一个552个氨基酸的蛋白,分子量大小为65 kU。氨基酸序列分析表明MCTs与来源于Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶相似性为92.36%,与其他已报道的海藻糖合酶有较大差异。MCTs具有高度保守的基序202DAVPYL207,244EANQ247和307RNHDEL312,以及活性中心三联体Asp202-Glu244-Asp310,三维建模结果显示MCTs的催化结构域具有典型的(α/β)8桶状结构,表明MCTs归属于糖苷水解酶GH13家族。重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量可溶性表达后,通过Ni^(2+)-NTA将目的蛋白纯化至电泳纯。重组酶rMCTs最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.5,最大比活力为105.6 U/mg。重组酶rMCTs在30℃下处理4 h,残留酶活为50%,但在65℃下处理1.5 h活力丧失。重组酶rMCTs在pH 5.0~8.0范围内有活性,在pH 6.0~7.5处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rMCTs有轻微的激活作用,Co^(2+)、Fe^(3+)、Cu^(2+)对重组酶rMCTs有抑制作用,其余金属离子对酶活力无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rMCTs有强烈的抑制作用,TritonX-100对rMCTs酶活力无显著影响。【结论】MCTs具有潜在的应用价值,丰富了海藻糖合成酶资源。
- 况丹黄奕晴徐嘉周昊王飞
- 关键词:海藻糖合酶基因克隆酶学特性
- 产海藻糖合酶枯草芽孢杆菌破壁及转化工艺研究
- 2023年
- 以细胞破碎率与海藻糖转化率为考察指标,确定发酵液破壁的最佳方式与参数。结果表明,采取高压均质机1000bar破壁两次破壁效果及海藻糖得率最佳,细胞破碎率可达99.32%,海藻糖转化率可达41.46%,较初始超声波破壁分别提升了12.31%,7.52%。采取单因素法,分别优化单酶法转化海藻糖的pH、温度,通过延长转化时间,监测转化过程中海藻糖得率的变化,确定不同转化时间糖得率的变化趋势,确定最佳的转化周期,并对胞内胞外酶转化的占比进行研究。结果显示,最佳转化条件为转化pH7.8,转化温度35℃,周期28h,在该工艺条件下进行转化,海藻糖浓度可达68.63g/L,较初始条件提升了41.88%,转化率可达48.16%,较未优化前提升了14.22%。
- 连战王松江郭传庄隋松森吕志飞李小双孙瑞成王建彬
- 关键词:海藻糖海藻糖合酶转化率
- 理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响
- 2023年
- [目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景,其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造,以期获得热稳定性强的突变子,提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测,以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体,经大肠杆菌表达和蛋白纯化后,对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH值和最适反应温度也未发生改变;R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍;在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2.41和4.32倍。[结论]本研究利用PoPMuSiC结合SDM、mCSM模拟的设计策略提高了TreSI的耐热性,为工业应用提供了新的酶资源,也为其他工业酶的定向改造提供了参考。
- 张丽霞黄奕晴吴嘉蕾李元顺王飞
- 关键词:海藻糖合酶定点突变热稳定性
- 一种海藻糖合酶突变体及其应用
- 本发明涉及一种海藻糖合酶突变体,属于基因工程技术领域。所述海藻糖合酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的。本发明在天然海藻糖合酶的基础上,通过...
- 张建涛张建波马春艳李志敏林玉房鸣
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- 一种固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法
- 本发明公开了一种固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法,本发明将海藻糖合酶通过双重吸附‑交联法固定于介孔分子筛SBA‑15上,用于催化麦芽糖产海藻糖,固定化方法简单、时间短、无污染、条件温和,固定化后的海藻糖合酶pH稳...
- 于令君郝云飞李莉
- 文献传递
- 聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法
- 本发明公开了聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法。本发明以聚丙烯腈膜为载体,采用吸附法固定化海藻糖合酶,用于催化麦芽糖产海藻糖,载体材料制备方法简单、操作容易、易于控制、成本低、可规模化生产且固定化条件简单...
- 楼志华丁红辉刘翔周立唐谋
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- 王瑞明

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